Evaluación de toxicidad de Saxitoxina (STX) utilizando metodologías alternativas en células de neuroblastoma de ratón
Autor: Ambbar Aballay González
Profesor: Dra. Allisson Astuya V (aastuya@udec.cl)
RESUMEN
Las intoxicaciones humanas por consumo de mariscos contaminados con toxinas marinas, son de preocupación mundial. En chile la presencia del Veneno Paralítico de Molusco (VPM), ha sido asociada a la aparición de blooms de Alexandrium catenella. Se han reportado desde 1972 a la fecha alrededor de 476 personas intoxicadas con VPM al consumir mariscos transvectores, que acumularon estas toxinas por filtración.
El VPM es una familia de ficotoxinas con una gran cantidad de derivados, todos ellos análogos a la Saxitoxina (STX), capaces de bloquear los canales de sodio sensibles a voltaje en la membrana de células eléctricamente excitables. Estas propiedades han permitido el planteamiento de metodologías alternativas al bioensayo ratón.
El objetivo de este estudio fue, implementar una técnica de detección para STX en células de neuroblastoma (N2a), validada internacionalmente y evaluar una alternativa a este ensayo, basada en la detección de una respuesta celular sub-letal frente a STX, que involucra la producción de estrés oxidativo, a través del incremento intracelular de las Especies Reactivas de Oxígeno (EROs).
Los datos experimentales obtenidos de la estimulación con STX en las células N2a, mostraron que esta gatilla un incremento intracelular de EROs detectable en un rango entre 33nM a 100nM de STX. Finalmente los resultados aportan información relevante de la existencia de un efecto de STX en la producción intracelular de EROs, convirtiéndose en una alternativa interesante para el estudio de los mecanismos involucrados en el estrés oxidativo como señales tempranas del efecto de STX y potenciales marcadores para su detección.
Las intoxicaciones humanas por consumo de mariscos contaminados con toxinas marinas, son de preocupación mundial. En chile la presencia del Veneno Paralítico de Molusco (VPM), ha sido asociada a la aparición de blooms de Alexandrium catenella. Se han reportado desde 1972 a la fecha alrededor de 476 personas intoxicadas con VPM al consumir mariscos transvectores, que acumularon estas toxinas por filtración.
El VPM es una familia de ficotoxinas con una gran cantidad de derivados, todos ellos análogos a la Saxitoxina (STX), capaces de bloquear los canales de sodio sensibles a voltaje en la membrana de células eléctricamente excitables. Estas propiedades han permitido el planteamiento de metodologías alternativas al bioensayo ratón.
El objetivo de este estudio fue, implementar una técnica de detección para STX en células de neuroblastoma (N2a), validada internacionalmente y evaluar una alternativa a este ensayo, basada en la detección de una respuesta celular sub-letal frente a STX, que involucra la producción de estrés oxidativo, a través del incremento intracelular de las Especies Reactivas de Oxígeno (EROs).
Los datos experimentales obtenidos de la estimulación con STX en las células N2a, mostraron que esta gatilla un incremento intracelular de EROs detectable en un rango entre 33nM a 100nM de STX. Finalmente los resultados aportan información relevante de la existencia de un efecto de STX en la producción intracelular de EROs, convirtiéndose en una alternativa interesante para el estudio de los mecanismos involucrados en el estrés oxidativo como señales tempranas del efecto de STX y potenciales marcadores para su detección.
Evaluación de toxicidad In Vitro frente a Heterosigma akashiwo (Raphidophyceae), utilizando Hsp70 como potencial marcador molecular de ictiotoxicidad
Autor: Carla Aburto Gajardo
Profesor: Dra. Allisson Astuya V (aastuya@udec.cl)
Caracterización Molecular de Protista Fungoide Thraustochytriidae presente en el Sistema de Corriente de Humboldt, frente a Concepción.
La astazantina es un carotenoide de alto valor comercial, que es intensamente utilizado en acuicultura, incorporando como suplemento al alimento de salmones, truchas y camarones. Puede obtenerse de fuentes tanto sintéticas como naturales. De estas últimas, en la microalga clorófita Haematococcus pluvialis, el contenido de este pigmento puede alcanzar entre un 1,5 - 4 % del peso seco del alga, del cual entre un 80% y 90% corresponde a ésteres de astazantina. En este estudio se evaluaron los atributos fisiológicos de 13 cepas chilenas y una extranjera de H. pluvialis, mediante análisis de crecimiento y cuantificación de carotenoides, con el objetivo de determinar si las diferencias en estos atributos fisiológicos se correlacionan con las diferencias genéticas encontradas previamente en estas cepas. En cuanto a los parámetros de crecimiento, la mayor tasa de crecimiento (div/día) fue alcanzada por la cepa CONC-036 y la mayor densidad celular (cel/ml) se presentó en las cepas CONC-021 y CONC-033. Los análisis de pigmentos revelaron que la cepa CONC-022 fue la más carotenogénica, expresado como carotenoides totales por volumen de cultivo, por biomasa y razón carotenoides / clorofila "a"; sin embargo, la cepa CONC-033 fue la más carotenogénica expresado como carotenoides por células (ug/cel). Se concluye que las cepas analizadas presentan diferencias en sus parámetros de crecimiento y capacidad carotenogénica pero que estas diferencias fisiológicas no se correlacionan con las diferencias genéticas previamente detectadas entre ellas.
Caracterización Molecular de la microbiota intestinal procarionte de Haliotis rufescens (abalón rojo) cultivado en Chile mediante análisis del ADNr 16S
RESUMEN
Las microalgas ictiotóxicas particularmente de la clase Raphidophyceae causan mortalidades masivas en peces silvestres y en cultivo, generando cuantiosas pérdidas en la industria acuícola a nivel mundial. La información actual para la detección de estas especies fitoplanctónicas no es suficiente para predecir su aparición, estimulando la búsqueda de nuevas estrategias que permitan el manejo oportuno de estos eventos ictiotóxicos.
El objetivo de este estudio fue evaluar la utilidad de Hsp70 como un potencial marcador molecular de ictiotoxicidad In Vitro, utilizando líneas celulares de salmónidos expuestos a especies reactivas de oxígeno y a la rafidofícea ictiotóxica Heterosigma akashiwo. Los resultados sugieren que existe un importante aumento a nivel transcripcional de Hsp70 frente a H2O2, el cuál es detectado durante las primeras horas de exposición (2-6 horas). Frente a la exposición de 600 células/mL de H. akashiwo, las líneas celulares muestran un incremento del doble en los niveles de expresión de Hsp70, comparadas con la exposición de dos microalgas no ictiotóxicas utilizadas como controles (Dunaliella tertiolecta y Rhodomonas salina). No obstante, al utilizar densidades mayores de las tres microalgas mecionadas (1000 células/ml) durante los experimentos de exposición, los resultados sugieren que no existen diferencias en el incremento de la expresión de Hsp70 entre estas.
Para entender el efecto de la densidad celular sobre la expresión de Hsp70, es necesario profundizar en la evolución de la producción de especies reactivas de oxígeno durante las fases de crecimiento de las microalgas utilizadas, además de la búsqueda de un nuevo diseño experimental que permita aislar el efecto ictiotóxico de H. akashiwo. Lo cual aportará información complementaria a los métodos tradicionales y así optimizar el proceso de toma de decisiones frente a los riesgos de las microalgas rafidofíceas en la industria acuícola.
Las microalgas ictiotóxicas particularmente de la clase Raphidophyceae causan mortalidades masivas en peces silvestres y en cultivo, generando cuantiosas pérdidas en la industria acuícola a nivel mundial. La información actual para la detección de estas especies fitoplanctónicas no es suficiente para predecir su aparición, estimulando la búsqueda de nuevas estrategias que permitan el manejo oportuno de estos eventos ictiotóxicos.
El objetivo de este estudio fue evaluar la utilidad de Hsp70 como un potencial marcador molecular de ictiotoxicidad In Vitro, utilizando líneas celulares de salmónidos expuestos a especies reactivas de oxígeno y a la rafidofícea ictiotóxica Heterosigma akashiwo. Los resultados sugieren que existe un importante aumento a nivel transcripcional de Hsp70 frente a H2O2, el cuál es detectado durante las primeras horas de exposición (2-6 horas). Frente a la exposición de 600 células/mL de H. akashiwo, las líneas celulares muestran un incremento del doble en los niveles de expresión de Hsp70, comparadas con la exposición de dos microalgas no ictiotóxicas utilizadas como controles (Dunaliella tertiolecta y Rhodomonas salina). No obstante, al utilizar densidades mayores de las tres microalgas mecionadas (1000 células/ml) durante los experimentos de exposición, los resultados sugieren que no existen diferencias en el incremento de la expresión de Hsp70 entre estas.
Para entender el efecto de la densidad celular sobre la expresión de Hsp70, es necesario profundizar en la evolución de la producción de especies reactivas de oxígeno durante las fases de crecimiento de las microalgas utilizadas, además de la búsqueda de un nuevo diseño experimental que permita aislar el efecto ictiotóxico de H. akashiwo. Lo cual aportará información complementaria a los métodos tradicionales y así optimizar el proceso de toma de decisiones frente a los riesgos de las microalgas rafidofíceas en la industria acuícola.
Determinación del efecto de saxitoxina de Alexandrium catenella sobre la actividad enzimática oxidativa en la línea celular N2a y hemocitos de Mytilus galloprovincialis. Búsqueda de nuevos biomarcadores de toxicidad para FAN
Autor: Verónica Avello Fontalba
Profesor: Dra. Allisson Astuya V (aastuya@udec.cl)
RESUMEN
Las Floraciones algales nocivas (FAN) corresponden a un fenómeno de proliferación excesiva de organismos fitoplanctónicos, los cuales han sido descritos como responsables de la producción de toxinas marinas. Estas toxinas suelen ser bioacumuladas en invertebrados marinos, provocando daños tanto a la salud humana como a la economía del país.
Un representante de los organismos productores de estos eventos, es Alexandrium catenella quien es conocido por generar toxinas paralíticas de moluscos (PSP). Dentro de este grupo podemos encontrar a Saxitoxina (STX), quien actúa sobre el sistema nervioso periférico y músculo esquelético, bloqueando los canales de sodio.
Debido a la escasa información de los efectos subletales de las toxinas marinas en bioensayos con animales enteros, se hace indispensable la búsqueda de nuevas herramientas dirigidas a detectar efectos tóxicos a nivel celular. Los antecedentes bibliográficos sugieren que Saxitoxina desencadena estrés oxidativo en las células expuestas. Es por esto, que el objetivo de este estudio es evaluar la respuesta de las enzimas antioxidantes superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT) en la línea celular N2a y en hemocitos de mejillón M. galloprovincialis frente a la exposición de Saxitoxina proveniente de Alexandrium catenella causante de fenómenos de Floraciones Algales Nocivas.
Los resultados obtenidos en este estudio sugieren que saxitoxina tiene un efecto sobre ambos tipos celulares, incrementando las actividades de las enzimas SOD y CAT. Sin embargo, si comparamos las respuestas entre ambos tipos celulares, los resultados sugieren incluso cuando el hemocitos muestran una baja actividad enzimática de SOD y CAT, que en células N2a. Los hemocitos aumentan el doble la actividad de SOD y CAT posterior a las 12 horas de exposición de STX en comparación con el control. Sin embargo, nuevas investigaciones deben llevarse a cabo en esa dirección.
Las Floraciones algales nocivas (FAN) corresponden a un fenómeno de proliferación excesiva de organismos fitoplanctónicos, los cuales han sido descritos como responsables de la producción de toxinas marinas. Estas toxinas suelen ser bioacumuladas en invertebrados marinos, provocando daños tanto a la salud humana como a la economía del país.
Un representante de los organismos productores de estos eventos, es Alexandrium catenella quien es conocido por generar toxinas paralíticas de moluscos (PSP). Dentro de este grupo podemos encontrar a Saxitoxina (STX), quien actúa sobre el sistema nervioso periférico y músculo esquelético, bloqueando los canales de sodio.
Debido a la escasa información de los efectos subletales de las toxinas marinas en bioensayos con animales enteros, se hace indispensable la búsqueda de nuevas herramientas dirigidas a detectar efectos tóxicos a nivel celular. Los antecedentes bibliográficos sugieren que Saxitoxina desencadena estrés oxidativo en las células expuestas. Es por esto, que el objetivo de este estudio es evaluar la respuesta de las enzimas antioxidantes superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT) en la línea celular N2a y en hemocitos de mejillón M. galloprovincialis frente a la exposición de Saxitoxina proveniente de Alexandrium catenella causante de fenómenos de Floraciones Algales Nocivas.
Los resultados obtenidos en este estudio sugieren que saxitoxina tiene un efecto sobre ambos tipos celulares, incrementando las actividades de las enzimas SOD y CAT. Sin embargo, si comparamos las respuestas entre ambos tipos celulares, los resultados sugieren incluso cuando el hemocitos muestran una baja actividad enzimática de SOD y CAT, que en células N2a. Los hemocitos aumentan el doble la actividad de SOD y CAT posterior a las 12 horas de exposición de STX en comparación con el control. Sin embargo, nuevas investigaciones deben llevarse a cabo en esa dirección.
Caracterización Molecular de Protista Fungoide Thraustochytriidae presente en el Sistema de Corriente de Humboldt, frente a Concepción.
Autor: Pablo Barra Fuentes
Profesor: Dr. Rodrigo González S. (rogonzal@udec.cl)
RESUMEN
Los Thraustoquitridios (THR) son microorganismos heterotróficos, de nutrición absorbente, comunes en la microflora marina y estuarial. También pueden encontrarse en ambientes salinos continentales o en zonas eutróficas como manglares. Su interés radica en dos aspectos; su posible capacidad de degradar materia orgánica refractaria (MOR) y su capacidad para acumular en sus células altas concentraciones de ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) omega 3, del tipo acido docosahexaenoico (DHA), fundamental para el desarrollo de muchos animales marinos. Por este motivo, su presencia puede ser de importancia en el ambiente en que viven. En Chile aun no existen estudios acerca de su ecología, impacto en las redes tróficas o su potencial uso biotecnológico, por lo que se desconoce su implicancia en zonas de interés comercial y ecosistemas de importancia, como el presente en el Sistema de Corrientes de Humbold (SCH), frente a Concepción. El objetivo de este trabajo buscó determinar la presencia de cepa(s) de la familia THR por medio del cultivo óptimo para su aislamiento, el uso de herramientas moleculares como, PCR, clonación y secuenciación de muestras obtenidas en el SCH y otras zonas de interés. También se estimó la abundancia de THR en la columna de agua de la serie de tiempo, estación 18 (SCH), por medio del número más probable (NMP) y el método de detección directa por tinción con acriflavina (AfDD). Los resultados muestran la presencia de THR en el SCH. Los organismos fueron aislados y su presencia confirmada por amplificación del gen 18S rRNA usando PCR. El fragmento de ADN amplificado fue clonado y su secuenciación se encuentra en progreso. La abundancia promedio de THR en la columna de agua fue estimada entre 2.96 x 104 y 3.88 x104 células/L. La relación Carbono/Nitrógeno estimada por NMP fue de 0.7 µg C/L y 0.076 µg N/L. Estos valores son consistentes con los estimados por medio de AfDD (0.6 µg C/L y 0.058 µg N/L) para células con diámetros entre 3.25 to 25 μm.
Los Thraustoquitridios (THR) son microorganismos heterotróficos, de nutrición absorbente, comunes en la microflora marina y estuarial. También pueden encontrarse en ambientes salinos continentales o en zonas eutróficas como manglares. Su interés radica en dos aspectos; su posible capacidad de degradar materia orgánica refractaria (MOR) y su capacidad para acumular en sus células altas concentraciones de ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) omega 3, del tipo acido docosahexaenoico (DHA), fundamental para el desarrollo de muchos animales marinos. Por este motivo, su presencia puede ser de importancia en el ambiente en que viven. En Chile aun no existen estudios acerca de su ecología, impacto en las redes tróficas o su potencial uso biotecnológico, por lo que se desconoce su implicancia en zonas de interés comercial y ecosistemas de importancia, como el presente en el Sistema de Corrientes de Humbold (SCH), frente a Concepción. El objetivo de este trabajo buscó determinar la presencia de cepa(s) de la familia THR por medio del cultivo óptimo para su aislamiento, el uso de herramientas moleculares como, PCR, clonación y secuenciación de muestras obtenidas en el SCH y otras zonas de interés. También se estimó la abundancia de THR en la columna de agua de la serie de tiempo, estación 18 (SCH), por medio del número más probable (NMP) y el método de detección directa por tinción con acriflavina (AfDD). Los resultados muestran la presencia de THR en el SCH. Los organismos fueron aislados y su presencia confirmada por amplificación del gen 18S rRNA usando PCR. El fragmento de ADN amplificado fue clonado y su secuenciación se encuentra en progreso. La abundancia promedio de THR en la columna de agua fue estimada entre 2.96 x 104 y 3.88 x104 células/L. La relación Carbono/Nitrógeno estimada por NMP fue de 0.7 µg C/L y 0.076 µg N/L. Estos valores son consistentes con los estimados por medio de AfDD (0.6 µg C/L y 0.058 µg N/L) para células con diámetros entre 3.25 to 25 μm.
Actividad Arginasa como Biomarcador de Estrés Ambiental en Larvas de Danio Rerio (Pez Cebra)
Autor: Pablo Fuentealba González.
Profesor: Dra. Alejandra Llanos R. (alllanos@udec.cl)
Dra. Amparo Uribe P (auribe@udec.cl)
RESUMEN
En organismos acuáticos los efectos de los xenobióticos pueden alterar el crecimiento e inactivar ciertas rutas biosintéticas, que pueden ser evidenciadas con la utilización de biomarcadores, entre los cuales están algunas enzimas. La enzima arginasa, cataliza la hidrólisis de arginina en ornitina y urea, generando así el sustrato necesario para la síntesis de poliaminas, las cuales desempeñan funciones en proliferación y diferenciación celular, es por esta razón que la actividad arginasa se utiliza como un biomarcador tumoral. Por lo anterior, en este estudio se propone validar a la actividad arginasa como un biomarcador de estrés ambiental a nivel subletal en estados tempranos de Danio rerio. La hipótesis postula que una disminución de la actividad arginasa, por exposición a concentraciones subletales de tóxico, está relacionada con la reducción del crecimiento de estados tempranos de Danio rerio.
En los ensayos realizados se utilizó como tóxico de referencia el malathion, pesticida organofosforado que inhibe la actividad de la acetilcolinesterasa así como el crecimiento larval en esta especie. El diseño experimental consideró la realización de bioensayos de 144 hrs, que incluye la exposición desde embrión temprano hasta la etapa larval de absorción del vitelo. Se evaluó los deltas de crecimiento y actividad arginasa larval, los que fueron posteriormente correlacionados y complementados con observaciones del desarrollo organogénico larval. Además se evaluó su uso como biomarcador, utilizando como agente estresor un residuo industrial líquido (RIL) de celulosa del Complejo Forestal e Industrial (CFI) - Nueva Aldea, mediante la misma metodología.
La medición de actividad específica de la arginasa fue de 0.025 ± 0,003 UI/mg de proteína, en larvas control al momento de la absorción del vitelo. Los resultados obtenidos de los bioensayos con malathion indicaron que existe una relación directa entre la actividad arginasa y desarrollo larval, por lo tanto esta enzima, demuestra ser un biomarcador subletal de estrés ambiental ligada a los procesos de maduración y condición larval. Los resultados obtenidos de los bioensayos con RIL de celulosa no registraron efectos significativos en los deltas de crecimiento, pero si retrasando la organogénesis. Esta alteración en presencia del RIL puede relacionarse con la variación no significativa detectada en la actividad arginasa en larvas de Danio rerio.
En organismos acuáticos los efectos de los xenobióticos pueden alterar el crecimiento e inactivar ciertas rutas biosintéticas, que pueden ser evidenciadas con la utilización de biomarcadores, entre los cuales están algunas enzimas. La enzima arginasa, cataliza la hidrólisis de arginina en ornitina y urea, generando así el sustrato necesario para la síntesis de poliaminas, las cuales desempeñan funciones en proliferación y diferenciación celular, es por esta razón que la actividad arginasa se utiliza como un biomarcador tumoral. Por lo anterior, en este estudio se propone validar a la actividad arginasa como un biomarcador de estrés ambiental a nivel subletal en estados tempranos de Danio rerio. La hipótesis postula que una disminución de la actividad arginasa, por exposición a concentraciones subletales de tóxico, está relacionada con la reducción del crecimiento de estados tempranos de Danio rerio.
En los ensayos realizados se utilizó como tóxico de referencia el malathion, pesticida organofosforado que inhibe la actividad de la acetilcolinesterasa así como el crecimiento larval en esta especie. El diseño experimental consideró la realización de bioensayos de 144 hrs, que incluye la exposición desde embrión temprano hasta la etapa larval de absorción del vitelo. Se evaluó los deltas de crecimiento y actividad arginasa larval, los que fueron posteriormente correlacionados y complementados con observaciones del desarrollo organogénico larval. Además se evaluó su uso como biomarcador, utilizando como agente estresor un residuo industrial líquido (RIL) de celulosa del Complejo Forestal e Industrial (CFI) - Nueva Aldea, mediante la misma metodología.
La medición de actividad específica de la arginasa fue de 0.025 ± 0,003 UI/mg de proteína, en larvas control al momento de la absorción del vitelo. Los resultados obtenidos de los bioensayos con malathion indicaron que existe una relación directa entre la actividad arginasa y desarrollo larval, por lo tanto esta enzima, demuestra ser un biomarcador subletal de estrés ambiental ligada a los procesos de maduración y condición larval. Los resultados obtenidos de los bioensayos con RIL de celulosa no registraron efectos significativos en los deltas de crecimiento, pero si retrasando la organogénesis. Esta alteración en presencia del RIL puede relacionarse con la variación no significativa detectada en la actividad arginasa en larvas de Danio rerio.
Estudio del potencial biotecnológico de distintos genotipos de Haematococcus pluvialis Flotow (Chlorophyta)
Autor: Jennifer Torres Ildefonso
Profesor: Dra. Patricia Gómez V. (pgomez@udec.cl)
Profesor: Dra. Patricia Gómez V. (pgomez@udec.cl)
La astazantina es un carotenoide de alto valor comercial, que es intensamente utilizado en acuicultura, incorporando como suplemento al alimento de salmones, truchas y camarones. Puede obtenerse de fuentes tanto sintéticas como naturales. De estas últimas, en la microalga clorófita Haematococcus pluvialis, el contenido de este pigmento puede alcanzar entre un 1,5 - 4 % del peso seco del alga, del cual entre un 80% y 90% corresponde a ésteres de astazantina. En este estudio se evaluaron los atributos fisiológicos de 13 cepas chilenas y una extranjera de H. pluvialis, mediante análisis de crecimiento y cuantificación de carotenoides, con el objetivo de determinar si las diferencias en estos atributos fisiológicos se correlacionan con las diferencias genéticas encontradas previamente en estas cepas. En cuanto a los parámetros de crecimiento, la mayor tasa de crecimiento (div/día) fue alcanzada por la cepa CONC-036 y la mayor densidad celular (cel/ml) se presentó en las cepas CONC-021 y CONC-033. Los análisis de pigmentos revelaron que la cepa CONC-022 fue la más carotenogénica, expresado como carotenoides totales por volumen de cultivo, por biomasa y razón carotenoides / clorofila "a"; sin embargo, la cepa CONC-033 fue la más carotenogénica expresado como carotenoides por células (ug/cel). Se concluye que las cepas analizadas presentan diferencias en sus parámetros de crecimiento y capacidad carotenogénica pero que estas diferencias fisiológicas no se correlacionan con las diferencias genéticas previamente detectadas entre ellas.
Diseño de una herramienta molecular para la identificación de Saprolegnia parasitica en los primeros estadios de salmónidos cultivados en Chile.
Autor: Pamela Ruiz Merino
RESUMEN
Las infecciones microbianas afectan a un gran número de especies de peces, produciendo no sólo disminución de las poblaciones, sino también una mala calidad de individuos tanto para la acuicultura como para la pesca. Saprolegnia parasitica ha sido reconocida como la principal especie patógena de organismos acuáticos infectados por hongos, aunque en estricto rigor es considerada parte del reino Chromista.
La identificación de especies de Saprolegnia es difícil utilizando criterios morfológicos tradicionales, además, los datos moleculares de representantes de la familia Saprolegniaceae en Chile son prácticamente inexistentes. Es por esto que se llevo a cabo la estandarización de las condiciones de cultivo de Saprolegnia en medio líquido para poder realizar estudios moleculares que permitan la identificación de Saprolegnia parasitica. Los resultados de este trabajo determinaron una concentración de antibiótico de 3000 U/mL, penicilina- estreptomicina, para un cultivo a T° ambiente y un fotoperiodo 16h/8h (día/noche). Además se determinó que el uso de cloranfenicol a una concentración de 0,2 mg/mL para el cultivo en agar Sabouraud disminuye la contaminación bacteriana. La amplificación por PCR de los cultivos realizados y positivos morfológicamente para Saprolegnia, permitió obtener mayoritariamente un producto amplificado de alrededor de 700-800pb, excepto para las cepas N° 11899 (Saprolegnia parasitica) y N° 94 (Saprolegnia diclina clade v) cuyo fragmento fue más pequeño (600-700 pb).
Mediante DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) se realizó la comparación de las diferentes cepas obtenidas, siendo la cepa N° 1 distinta al resto de las analizadas. Aunque no hay una correlación en las diferencias encontradas por medio de estas dos técnicas moleculares, su uso de manera complementaria podría ser potencialmente utilizado en la caracterización del género Saprolegnia
Finalmente se seleccionaron clones que contienen los productos de PCR amplificados y fueron mandados a secuenciar
Las infecciones microbianas afectan a un gran número de especies de peces, produciendo no sólo disminución de las poblaciones, sino también una mala calidad de individuos tanto para la acuicultura como para la pesca. Saprolegnia parasitica ha sido reconocida como la principal especie patógena de organismos acuáticos infectados por hongos, aunque en estricto rigor es considerada parte del reino Chromista.
La identificación de especies de Saprolegnia es difícil utilizando criterios morfológicos tradicionales, además, los datos moleculares de representantes de la familia Saprolegniaceae en Chile son prácticamente inexistentes. Es por esto que se llevo a cabo la estandarización de las condiciones de cultivo de Saprolegnia en medio líquido para poder realizar estudios moleculares que permitan la identificación de Saprolegnia parasitica. Los resultados de este trabajo determinaron una concentración de antibiótico de 3000 U/mL, penicilina- estreptomicina, para un cultivo a T° ambiente y un fotoperiodo 16h/8h (día/noche). Además se determinó que el uso de cloranfenicol a una concentración de 0,2 mg/mL para el cultivo en agar Sabouraud disminuye la contaminación bacteriana. La amplificación por PCR de los cultivos realizados y positivos morfológicamente para Saprolegnia, permitió obtener mayoritariamente un producto amplificado de alrededor de 700-800pb, excepto para las cepas N° 11899 (Saprolegnia parasitica) y N° 94 (Saprolegnia diclina clade v) cuyo fragmento fue más pequeño (600-700 pb).
Mediante DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) se realizó la comparación de las diferentes cepas obtenidas, siendo la cepa N° 1 distinta al resto de las analizadas. Aunque no hay una correlación en las diferencias encontradas por medio de estas dos técnicas moleculares, su uso de manera complementaria podría ser potencialmente utilizado en la caracterización del género Saprolegnia
Finalmente se seleccionaron clones que contienen los productos de PCR amplificados y fueron mandados a secuenciar
Caracterización Molecular de la microbiota intestinal procarionte de Haliotis rufescens (abalón rojo) cultivado en Chile mediante análisis del ADNr 16S
Autor: Silvia Rojas C
Profesor: Dr. Homero Urrutia B. (hurrutia@udec.cl)
Dr. Cristian Gallardo E. (crisgallardo@udec.cl)
Profesor: Dr. Homero Urrutia B. (hurrutia@udec.cl)
Dr. Cristian Gallardo E. (crisgallardo@udec.cl)
RESUMEN
Un adecuado control del balance microbiano intestinal en Haliotis rufescens puede ser una herramienta importante para conseguir altas eficiencias alimenticias y defensa frente a enfermedades. En este estudio se caracterizó la microbiota intestinal de Haliotis rufescens mediante análisis del ADNr 16S utilizando hibridación en membrana (Dot Blot) y electroforesis en gel con gradiente denaturante (DGGE). Se extrajo ARN desde el tracto digestivo de individuos cultivados en Coquimbo (IV Región, Chile) y Puerto Montt (X Región, Chile) y se hibridó con sondas específicas para ARNr 16S de cada dominio (Bacteria: Proteobacteria, Firmicutes; Archaea: Euryarchaea, Crenarchaea). Para obtener un perfil de diversidad se extrajo ADN, se amplificó mediante PCR anidado (341F GC-clamp; 534R) la secuencia de la subunidad menor del ADNr 16S y se sometió a DGGE. Las bandas dominantes fueron secuenciadas y comparadas con las bases de datos en GenBank mediante BLAST. Losresultados de la hidridación Dot Blot indican la presencia tanto del dominio Bacteria como del dominio Archaea, estas últimas no reportadas previamente. Cada dominio presenta abundancias relativas similares (Individuos IV Región: Bacteria 48.2% y 50.9% Archaea; X Región: Bateroa 46.6% y 50.1% Archaea) y presencia de variedad de clases, siendo las Alpha-proteobacterias las más abundantes (48.3%). El patrón de bandcas obtenido por DGGE indica diferencias significativas en la diversidad de la comunidad microbiana intestinal procarionte presente en los individuos cultivados en el norte, comprarada con la de los individuos cultivados en el sur. Las secuencias cultivados en el norte, comparada con la de lo individuos cultivados en el sur. las secuencias de las bandas extraídas del patrón obtenido indican que la microbiota intestinal de H. rufescens estaría compuesta por Pseudomomas sp., Vibio egregius, fusobacteria, Spirochaeta sp. e Ilyobacter sp., todos ellos reportados previamente en el intestino de Haliotis spp. (excepto Spirochaeta sp.). Estudios posteriores deben ser llevados a cabo para identificar a otros miembros de la microbiota intestinal, y asi dar inicio al entendimiento de la dinámica e importancia de esta comunidad de hospedador invertebrado.
Un adecuado control del balance microbiano intestinal en Haliotis rufescens puede ser una herramienta importante para conseguir altas eficiencias alimenticias y defensa frente a enfermedades. En este estudio se caracterizó la microbiota intestinal de Haliotis rufescens mediante análisis del ADNr 16S utilizando hibridación en membrana (Dot Blot) y electroforesis en gel con gradiente denaturante (DGGE). Se extrajo ARN desde el tracto digestivo de individuos cultivados en Coquimbo (IV Región, Chile) y Puerto Montt (X Región, Chile) y se hibridó con sondas específicas para ARNr 16S de cada dominio (Bacteria: Proteobacteria, Firmicutes; Archaea: Euryarchaea, Crenarchaea). Para obtener un perfil de diversidad se extrajo ADN, se amplificó mediante PCR anidado (341F GC-clamp; 534R) la secuencia de la subunidad menor del ADNr 16S y se sometió a DGGE. Las bandas dominantes fueron secuenciadas y comparadas con las bases de datos en GenBank mediante BLAST. Losresultados de la hidridación Dot Blot indican la presencia tanto del dominio Bacteria como del dominio Archaea, estas últimas no reportadas previamente. Cada dominio presenta abundancias relativas similares (Individuos IV Región: Bacteria 48.2% y 50.9% Archaea; X Región: Bateroa 46.6% y 50.1% Archaea) y presencia de variedad de clases, siendo las Alpha-proteobacterias las más abundantes (48.3%). El patrón de bandcas obtenido por DGGE indica diferencias significativas en la diversidad de la comunidad microbiana intestinal procarionte presente en los individuos cultivados en el norte, comprarada con la de los individuos cultivados en el sur. Las secuencias cultivados en el norte, comparada con la de lo individuos cultivados en el sur. las secuencias de las bandas extraídas del patrón obtenido indican que la microbiota intestinal de H. rufescens estaría compuesta por Pseudomomas sp., Vibio egregius, fusobacteria, Spirochaeta sp. e Ilyobacter sp., todos ellos reportados previamente en el intestino de Haliotis spp. (excepto Spirochaeta sp.). Estudios posteriores deben ser llevados a cabo para identificar a otros miembros de la microbiota intestinal, y asi dar inicio al entendimiento de la dinámica e importancia de esta comunidad de hospedador invertebrado.