Caracterización del gen del receptor de insulina–like y análisis de su expresión génica en Mesodesma donacium (Lamarck, 1818)
Autor: Pamela Alarcón Matus
Profesor: Dr. Cristian Gallardo Escarate. (crisgallardo@udec.cl)
RESUMEN
El receptor de insulina, perteneciente a los receptores tirosina quinasa de la membrana celular, se compone de 4 sub-unidades, dos alfa y dos beta, teniendo esta últimas un dominio conservado tirosina quinasa (Residuo unión ATP: Lys1030; Residuos reguladores: Tyr1146, Tyr1150 y Tyr1151). Dicho receptor ha sido descrito en una gran variedad de especies tanto vertebrados como invertebrados y cuyo rol fundamental de señalización en la vía de la insulina gatilla una cascada de señales para la estimulación de vías metabólicas de glucosa, proteínas y lípidos (MAP y PI3K); síntesis de ADN y replicación celular, por medio de la fosforilación de sustratos proteicos y mensajeros secundarios (Akt, Grb2, Ras, entre otros). Estos procesos son centrales en la mitosis celular y crecimiento somático. Considerando que varios de los intermediarios de esta vía se han encontrado en invertebrados y el carácter conservado que se le ha otorgado principalmente al dominio tirosina quinasa del receptor de insulina, es que se presume que su rol en invertebrados (“receptor de insuline-like”) estaría asociado a proliferación celular y crecimiento de organismos. El presente estudio pretende caracterizar a nivel molecular el receptor de insuline-like en el bivalvo Mesodesma donacium y evaluar los patrones de expresión trascriptómica mediante PCR en tiempo real en individuos sometidos a alimentación constante e inanición, con la finalidad de generar una respuesta a nivel metabólico que permita observar variaciones en la expresión del gen. Se obtuvo una secuencia parcial de 767pb, la que presenta homología con otras secuencias reportadas para este gen en invertebrados. Adicionalmente, el análisis por qPCR mostró mayores niveles de expresión en glándula digestiva por sobre otros tejidos (manto, pie, gónada y branquia). Por otra parte, los organismos alimentados presentaron mayores niveles de expresión del receptor de insuline-like en todos los tiempos muestreados. Los resultados obtenidos en el presente estudio, apoyan la hipótesis de que el receptor de insuline-like se encuentra ligado al crecimiento en Mesodesma donacium , y por ende puede ser desarrollado como potencial marcador de este carácter en invertebrados de importancia comercial.
Evaluación del potencial uso de un ensayo celular alternativo al bioensayo en ratón para la detección de STX desde mitílidos contaminados.
Autor: Paula Arias Velasquez
Profesor: Dra. Allisson Astuya V. (aastuya@udec.cl)
RESUMEN
El receptor de insulina, perteneciente a los receptores tirosina quinasa de la membrana celular, se compone de 4 sub-unidades, dos alfa y dos beta, teniendo esta últimas un dominio conservado tirosina quinasa (Residuo unión ATP: Lys1030; Residuos reguladores: Tyr1146, Tyr1150 y Tyr1151). Dicho receptor ha sido descrito en una gran variedad de especies tanto vertebrados como invertebrados y cuyo rol fundamental de señalización en la vía de la insulina gatilla una cascada de señales para la estimulación de vías metabólicas de glucosa, proteínas y lípidos (MAP y PI3K); síntesis de ADN y replicación celular, por medio de la fosforilación de sustratos proteicos y mensajeros secundarios (Akt, Grb2, Ras, entre otros). Estos procesos son centrales en la mitosis celular y crecimiento somático. Considerando que varios de los intermediarios de esta vía se han encontrado en invertebrados y el carácter conservado que se le ha otorgado principalmente al dominio tirosina quinasa del receptor de insulina, es que se presume que su rol en invertebrados (“receptor de insuline-like”) estaría asociado a proliferación celular y crecimiento de organismos. El presente estudio pretende caracterizar a nivel molecular el receptor de insuline-like en el bivalvo Mesodesma donacium y evaluar los patrones de expresión trascriptómica mediante PCR en tiempo real en individuos sometidos a alimentación constante e inanición, con la finalidad de generar una respuesta a nivel metabólico que permita observar variaciones en la expresión del gen. Se obtuvo una secuencia parcial de 767pb, la que presenta homología con otras secuencias reportadas para este gen en invertebrados. Adicionalmente, el análisis por qPCR mostró mayores niveles de expresión en glándula digestiva por sobre otros tejidos (manto, pie, gónada y branquia). Por otra parte, los organismos alimentados presentaron mayores niveles de expresión del receptor de insuline-like en todos los tiempos muestreados. Los resultados obtenidos en el presente estudio, apoyan la hipótesis de que el receptor de insuline-like se encuentra ligado al crecimiento en Mesodesma donacium, y por ende puede ser desarrollado como potencial marcador de este carácter en invertebrados de importancia comercial.
Propuesta de certificación para algas de interés comercial en la región del Bío-Bío mediante ADN barcote
Autor: Vessna Barrera Bustamante
Profesor: Dr. Erasmo Macaya H. (erasmomacaya@udec.cl)
RESUMEN
En Chile las algas representan una parte importante del sector exportador, ya que su extracción y comercialización involucra a pescadores artesanales y pequeñas, medianas y grandes empresas. Para poder exportar algas, competir y generar confianza en mercados internacionales, es fundamental contar con sistemas que aseguren un producto bien rotulado, pero debido a la alta plasticidad morfológica y la evolución convergente de estos organismos, su clasificación se hace extremadamente compleja y muchas veces errónea, lo cual puede derivar en un rotulado incorrecto de productos a exportar. Es por eso que el desarrollo de nuevas técnicas moleculares, tales como “ADN Barcode”, han contribuido en la identificación de muchas especies y productos ya procesados, tales como carnes, vegetales, pescados y mariscos entre otros, regulando esta actividad. Para el caso de algas esta actividad no está regulada, es por eso que este estudio es de real importancia para contribuir a la identificación, tanto de las especies extraídas, como en la confianza que se genera con los consumidores. Esta herramienta emplea la amplificación de segmentos de ADN mitocondrial - gen del Citocromo c Oxidasa I (COI), los que son contrastados con bases de datos existentes permitiendo así identificar muestras de algas desconocidas (secas o procesadas). El objetivo de este trabajo fue verificar la implementación de esta técnica en algas de interés comercial, para dar paso a la certificación de las especies exportadas desde las costas de la región del Bio-Bío, Chile, posibilitando el aumento del valor agregado y la competitividad en el mercado. Para su realización se recolectaron 11 muestras. Las bases de datos consultadas fueron Barcode of Life Data System (BOLD System) y Genbank. Del total de especies, sólo 5 poseían registros de secuencia en BOLD y Genbank (D. antarctica, G. chilensis, M. pyrifera, M. laminarioides, Porphyra sp.) mientras que las otras 6 especies (C. chamissoi, L. nigrescens, L. trabeculata, M. latissimus, M. membranacea y S. crispata) no. Además se realizó un análisis para determinar la calidad/cantidad de ADN en muestras secadas al sol debido a una posible degradación de éste, la cual obtuvo como resultado que no ocurrió fragmentación del ADN. Finalmente esta técnica es propuesta a las empresas para una posible certificación/rotulación molecular de los productos exportados, aumentando el valor agregado, la trazabilidad y la confianza en los consumidores.
Caracterización de ferritina e dentificación de polimorfismo de único nucleótido (SNP) asociado a respuestas inmune innata de Concholepas concholepas
Autor: Jacqueline Chavez Mardones
Profesor: Dr. Cristian Gallardo Escarate. (crisgallardo@udec.cl)
RESUMEN
Ferritina es una proteína que constituye la principal forma de almacenamiento de hierro a nivel celular. Sin embargo, estudios previos han sugerido que su expresión estaría relacionada de igual forma con la exposición a patógenos que estimulan la generación de ROS en invertebrados marinos. El objetivo general del presente trabajo fue caracterizar el gen Ferritina en Concholepas concholepas (CcFer) y evaluar los niveles de expresión génica en respuesta a la exposición a patógenos. Adicionalmente, se verificó la presencia de polimorfismos de un único nucleótido (SNP) en CcFer y su asociación con los niveles de respuesta de transcripción. A partir de una biblioteca de cDNA de C. concholepas se obtuvo el contig 20527 anotado para Ferritina, desde donde se diseñaron partidores para la amplificación del mRNA. Paralelamente, se realizó un desafío donde se expuso a 18 organismos de C. concholepas al patógeno Vibrio anguillarum, para luego medir su expresión mediante qPCR. Finalmente se analizó la correlación de un SNP identificado por análisis bioinformático entre el grupo control y desafiado mediante un análisis de High-Resolution Melting (HRM). De acuerdo a los análisis, CcFer presenta una secuencia parcial 5`UTR de 159pb que contiene el elemento regulador de hierro (IRE) y un marco de lectura (ORF) de 513pb que codifica para una proteína de 171 aminoácidos. De acuerdo al análisis Blastn esta secuencia es similar a Ferritina-H perteneciente a vertebrados. Adicionalmente, se identificó dos sitios de unión a Hiero (IBRS 1 – 2). El SNP se encuentra ubicado en 64pb antes del inicio de la transcripción. El análisis de expresión génica indicó que CcFer se sobre-expresa frente a la infección con Vibrio anguillarum, presentando un peak de expresión a las 6 horas post-infección para luego descender hasta las 33 horas resultados que son estadísticamente significativos. Por otro lado, el análisis de SNPs mostró que el genotipo homocigoto mutante (TT) muestra una mayor expresión en el grupo desafiado a diferencia de la forma nativa (CC) y el heterocigoto (CT) que registran una expresión menor tanto en el grupo control como el desafiado. Estos resultados sugieren que CcFer está asociado con la respuesta inmune de este invertebrado acuático, y que su SNP puede estar involucrado en la regulación de sus niveles de expresión génica. Adicionalmente, se discute su potencial uso en la identificación de la respuesta inmuno-genómica de C. concholepas frente a patógenos.
Identificación de marcadores moleculares para determinar calidad de ovocitos en Oncorhynchus mykiss.
Autor: Juan Pablo Alvarez Cereceda
Profesor: Dra. Alejandra Llanos R. (alllanos@udec.cl)
: Dr. Fernando Cruzat C. (fcruzat@udec.cl)
RESUMEN
En acuicultura, se han definido como ovocitos de buena calidad aquellos que presentan una baja mortalidad al momento de la fertilización, desarrollo embrionario y primera alimentación. Basado en que la abundancia de determinados ARNm maternales incorporados durante la ovogénesis puede afectar significativamente la calidad de los ovocitos el presente estudio busco establecer diferencias significativas en los niveles de expresión de los ARNm maternales IGF-I, PHB2, Zorba, Pou2 en ovocitos de Oncorhynchus mykiss de alta y baja calidad. Además se evaluó las correlaciones entres los niveles de expresión de cada transcrito analizado y los porcentajes de sobrevivencia de la descendencia al decimo día de desarrollo post fertilización.
Se logró establecer que existen diferencias entre los niveles de expresión relativa de IGF-I, PHB2, Zorba y Pou2 entre los grupo de alta y baja calidad. Sin embargo estos estas diferencias sólo fueron significativas para Zorba, cuantificándose en los ovocitos de baja calidad una mayor expresión con respecto a los de alta (1,0 ±0,6 y 16,9 ±1,0 respectivamente). También se determino que Zorba resulto correlacionarse negativamente con la sobrevivencia temprana de O. mykiss.
Se logró establecer que existen diferencias entre los niveles de expresión relativa de IGF-I, PHB2, Zorba y Pou2 entre los grupo de alta y baja calidad. Sin embargo estos estas diferencias sólo fueron significativas para Zorba, cuantificándose en los ovocitos de baja calidad una mayor expresión con respecto a los de alta (1,0 ±0,6 y 16,9 ±1,0 respectivamente). También se determino que Zorba resulto correlacionarse negativamente con la sobrevivencia temprana de O. mykiss.
Metodologia para la extracción de residuos de florfenicol en muestras ambientales provenientes de centros de cultivo de salmon.
Autor: Stephanie Constanzo Maldonado.
Profesor: Dr. Ricardo Barra R. (ricbarra@udec.cl)
RESUMEN
Detección e identificación molecular de dinoflagelados del género Dinophysis spp y de la especie Alexandrium catenella desde la columna de agua.
Autor: Federico Corral Marchant
Profesor: Dr. Fernando Cruzat C. (fcruzat@udec.cl)
RESUMEN
Las Floraciones Algales Nocivas (FANs) corresponden a fenómenos naturales que surgen debido al crecimiento excesivo de protistas y/o microalgas del ecosistema marino en donde ciertas especies son capaces de sintetizar toxinas bioacumulables por otros organismos. En nuestro país se ha registrado la presencia de dinoflagelados del género Dinophysis spp, y Alexandrium spp., particularmente la especie Alexandrium catenella, implicados como principales agentes causales de los síndromes del Veneno Paralizante de Mariscos, y Veneno Diarreico de Mariscos, respectivamente. La identificación y diferenciación de estos agentes causales tradicionalmente se realiza por medio de microscopía, pero esto corresponde a un procedimiento lento y que requiere la expertiz de taxónomos calificados. Sin embargo, en la última década se han desarrollado técnicas moleculares basadas en la identificación de la región ribosomal del ADN genómico de la especie diana, las cuales pueden ser posteriormente amplificadas mediante la técnica de PCR. El objetivo principal de la presente investigación fue desarrollar un protocolo molecular basado en la amplificación de regiones ribosomales por PCR, para realizar la detección de dinoflagelados del género Dinophysis spp. y de la especie A. catenella desde muestras ambientales del Canal Puyuhuapi, XI región de Chile. Para ello, se aislaron células del género Dinophysis spp. las cuales fueron utilizadas como templado para amplificar la región ribosomal. Los productos obtenidos fueron posteriormente secuenciados y alineados frente a secuencias dispuestas en NCBI database, en donde se obtuvo un 61% de identidad para la región ribosomal descrita para el género Dinophysis spp., y 78% para la región ribosomal de la especie Prorocentrum micans. Esto permite sugerir que los partidores utilizados no son específicos para el género Dinophysis spp. En cuanto a la especie Alexandrium catenella, sólo se logró amplificar la región ribosomal en tres muestras ambientales provenientes de la campaña de Noviembre de 2010, de un total de 135 estaciones procesadas, lo cual fue posteriormente verificado mediante qPCR. Estas detecciones fueron analizadas en función de ciertos parámetros oceanográficos del Canal Puyuhuapi, determinando que la presencia de A. catenella se dio lugar a 10m, 25m y 50m de profundidad. De los resultados obtenidos se concluye que la detección de dinoflagelados desde la columna de agua mediante amplificación por PCR puede representar una herramienta rápida, sensible y complementaria a los actuales métodos de detección de agentes causales de FANs.
Estandarización y validación de un ensayo PCR tiempo real en formato individual y dúplex para el diagnóstico de Renibacterium salmoninarum.
Autor: Marcela Espinoza Monje
Profesor: Dra. Maria E. Cabrejos M (Aquainnovo)
RESUMEN
Una de las enfermedades más prevalentes en los centros productivos de salmonidos es la enfermedad bacteriana del riñón (BKD), causada por Renibacterium salmoninarum, organismo patógeno gram positivo, causante de grandes pérdidas de peces salmónidos. Actualmente se utilizan tres métodos diagnósticos para la detección del patógeno, los cuales son: Inmunofluorescencia indirecta (IFAT), Inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y RT-PCR.
Este proyecto busca desarrollar y optimizar un ensayo diagnóstico utilizando la técnica de PCR tiempo real a partir de material genético de R. salmoninarum, y validarlos con muestras biológicas de Salmo salar sanos y enfermos. Para esto se diseñaron dos juegos de partidores y una sonda utilizando la secuencia del gen msa1, y se escogió la mejor combinación. Ademas se estandarizó el ensayo en formato individual comparándolo con un juego de partidores usados actualmente para el diagnóstico de la enfermedad y en formato dúplex utilizando como control interno el Factor de Elongación 1α (elf1α). El ensayo se validó utilizando 200 peces de campo, los cuales consistieron en 100 peces sanos y 100 peces enfermos, en donde se comparó el ensayo individual y dúplex con la técnica IFAT (Gold estándar). El ensayo dúplex demostró un 86% de concordancia entre ambas técnicas (utilizando ADN), aumentando a 94% utilizando ARN. Adicionalmente, la validación del ensayo en formato individual a partir de ADN y ARN, resultó en un 100% de concordancia con la técnica IFAT. Estos resultados nos indican que aún se requieren más ensayos de optimización para poder usar el ensayo dúplex en el área de diagnóstico.
Este proyecto busca desarrollar y optimizar un ensayo diagnóstico utilizando la técnica de PCR tiempo real a partir de material genético de R. salmoninarum, y validarlos con muestras biológicas de Salmo salar sanos y enfermos. Para esto se diseñaron dos juegos de partidores y una sonda utilizando la secuencia del gen msa1, y se escogió la mejor combinación. Ademas se estandarizó el ensayo en formato individual comparándolo con un juego de partidores usados actualmente para el diagnóstico de la enfermedad y en formato dúplex utilizando como control interno el Factor de Elongación 1α (elf1α). El ensayo se validó utilizando 200 peces de campo, los cuales consistieron en 100 peces sanos y 100 peces enfermos, en donde se comparó el ensayo individual y dúplex con la técnica IFAT (Gold estándar). El ensayo dúplex demostró un 86% de concordancia entre ambas técnicas (utilizando ADN), aumentando a 94% utilizando ARN. Adicionalmente, la validación del ensayo en formato individual a partir de ADN y ARN, resultó en un 100% de concordancia con la técnica IFAT. Estos resultados nos indican que aún se requieren más ensayos de optimización para poder usar el ensayo dúplex en el área de diagnóstico.
Identificación de elementos reguladores funcionales en el Intrón 5 del Gen RUNX1
Autor: Valentina Fernández Espinoza
Profesor: Dra. Soraya Gutierrez G (sgutierr@udec.cl)
RESUMEN
Una de las herramientas más ampliamente utilizadas en la biotecnología ha sido la obtención de organismos transgénicos. Las modificaciones genómicas se llevan a cabo utilizando vectores de transgénesis, los que deben contener regiones regulatorias mínimas. Entre los elementos regulatorios están los módulos actuando en cis, como los enhancers, los que poseen la habilidad de dirigir y controlar la expresión de genes de una manera espacio/temporal específica, son independientes de posición y distancia con respecto al promotor y pueden estar inmersos en intrones o en regiones intergénicas. Los primeros estudios de transgénesis demostraron que la expresión selectiva, órgano y celular-específica está asociada a la presencia de regiones de control transcripcional cruciales.
Como metodología de predicción de elementos reguladores en cis, están los métodos bioinformáticos de análisis comparativo de especies divergentes y también la identificación de regiones hipersensibles (HS) a DNasa I. Estas últimas corresponden a regiones que se co-relacionan con enriquecimiento en marcas epigenéticas asociadas a enhancers y cromatina activa.
El gen RUNX1 es blanco de la translocación t(8;21) donde el quiebre ocurre en el intrón 5, el que además posee sitios HS a DNasa I, hiperacetilación en las histonas H3 y H4 y enriquecimiento en marcas epigenéticas. Rebolledo (2009) identificó nueve CNS en el intrón 5 del gen RUNX1. De los elementos reguladores putativos, CNS-T2 posee el mayor grado de conservación, contiene sitios predichos de unión para factores de transcripción y se encuentra próxima a una región enriquecida en la marca epigenética H3K9/14Ac, altamente sociada a enhancers. En base a estos antecedentes se postuló que la región CNS-T2 podría actuar como elemento regulador de la transcripción. Para definir la función de esta región, se realizaron estudios de transfección en modelos ex vivo, con la región putativa asociada al promotor P1 de RUNX1 y a la región regulatoria completa, P1-5’UTR, del mismo gen. Se evaluó si CNS-T2 actúa como elemento regulador tejido-específico, realizando ensayos de transfección en células de distintos linajes. Nuestros resultados muestran que la región CNS – T2 actúa como elemento regulador de la transcripción en cis, de forma tejido específica, lo que concuerda con las predicciones in silico y con las características estructurales y epigenéticas del intrón 5 del gen RUNX1.
Como metodología de predicción de elementos reguladores en cis, están los métodos bioinformáticos de análisis comparativo de especies divergentes y también la identificación de regiones hipersensibles (HS) a DNasa I. Estas últimas corresponden a regiones que se co-relacionan con enriquecimiento en marcas epigenéticas asociadas a enhancers y cromatina activa.
El gen RUNX1 es blanco de la translocación t(8;21) donde el quiebre ocurre en el intrón 5, el que además posee sitios HS a DNasa I, hiperacetilación en las histonas H3 y H4 y enriquecimiento en marcas epigenéticas. Rebolledo (2009) identificó nueve CNS en el intrón 5 del gen RUNX1. De los elementos reguladores putativos, CNS-T2 posee el mayor grado de conservación, contiene sitios predichos de unión para factores de transcripción y se encuentra próxima a una región enriquecida en la marca epigenética H3K9/14Ac, altamente sociada a enhancers. En base a estos antecedentes se postuló que la región CNS-T2 podría actuar como elemento regulador de la transcripción. Para definir la función de esta región, se realizaron estudios de transfección en modelos ex vivo, con la región putativa asociada al promotor P1 de RUNX1 y a la región regulatoria completa, P1-5’UTR, del mismo gen. Se evaluó si CNS-T2 actúa como elemento regulador tejido-específico, realizando ensayos de transfección en células de distintos linajes. Nuestros resultados muestran que la región CNS – T2 actúa como elemento regulador de la transcripción en cis, de forma tejido específica, lo que concuerda con las predicciones in silico y con las características estructurales y epigenéticas del intrón 5 del gen RUNX1.
Evaluación de parámetros inmunológicos y susceptibilidad a enfermedades en truchas arcoíris (Oncorhynchus mykiss) sometidas al potencial efecto estresor del fotoperiodo artificial.
Autor: Pamela Gutierrez Crisosto
Profesor: Dra. Margarita González R. (magonzal@udec.cl)
Dr. Ariel Valenzuela S (avalenz@udec.cl)
RESUMEN
La aplicación de técnicas que permitan acelerar el crecimiento y/o modificar el periodo de maduración sexual en salmónidos son comunes en los centros de cultivo en Chile y el mundo, siendo una de ellas, la aplicación de fotoperiodo artificial (FA). Se ha descrito inmunosupresión por FA, asociado a estrés, sin embargo, también existe evidencia que lo descarta, por lo cual, la asociación fotoperiodo-estrés- inmunosupresión aún no es del todo clara encontrando mayor incidencia a enfermarse los peces sometidos a FA. Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue evaluar el sistema inmune en truchas y como el posible estrés generado por FA, influye en la susceptibilidad a enfermedades. Se trabajó con juveniles de trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) a las cuales se aplicó FA durante 2 meses (LD24:00 y LD14:10), dejándolas luego bajo fotoperiodo natural (FN). Como grupo control, se consideraron grupos bajo FN durante todo el periodo experimental. Como indicador de estrés se contempló la concentración de cortisol plasmático, como parámetros inmunológicos; la cuantificación de Proteínas totales, Leucocitos, Actividad Específica de lisozima e IgM plasmáticos, la susceptibilidad a enfermedades se evaluó mediante el registro de la mortalidad asociada a fotoperiodo. Se comprueba el carácter de estresor agudo del FA, para en ambas condiciones experimentales, repercutiendo en forma negativa sobre las barreras innatas de las truchas (Proteínas totales, Leucocitos, Lisozima), situación reiterada para LD 14:10 al volver a FN, exhibiendo una respuesta de tipo crónica al estrés. Los primeros signos clínicos de enfermedad se manifestaron con un oscurecimiento de la piel, nado errático, letárgico y posterior muerte (Control 7%, LD24:0 25%, LD14:10 36%), A nivel morfológico se observaron lesiones ulcerativas y necróticas de aspecto crónico con infiltrado celular. De los exámenes microbiológico e histología se registró cepas del grupo Flavobacterium psychrophilum, en asociación con Aeromonas, Pseudomonas y Saprolegnia sp. En conclusión, este estudio sugiere que truchas bajo y post condiciones de FA, manifiestan signos clínicos asociadas a estrés, el cual actúa repercutiendo sobre las barreras defensivas de tipo innata, dejando a esta especie más susceptibles a contagiarse con patógenos oportunistas. Por lo tanto, se aconseja al piscicultor, considerar el uso de: técnicas de monitoreo, inmuno-diagnóstico y tratamiento con inmuno-estimulantes que le permitan prevenir perdidas indeseables en la producción.
Evaluación de expresión de lustrin A, ferritina y ornitina decarboxilasa asociados a crecimiento en abalon rojo (Haliotis rufescens).
Autor: Germain Gutiérrez Sanhueza
Profesor: Dr. Cristian Gallardo Escarate. (crisgallardo@udec.cl)
RESUMEN
Dentro de las funciones de los genes lustrin A, ferritina y ornitina decarboxilasa (ODC) se encuentran la biomineralización, almacenamiento de hierro y síntesis de poliaminas respectivamente. Estudios previos han relacionado estos genes con el crecimiento somático en invertebrados marinos. El objetivo de este trabajo fue evaluar estos tres genes candidatos para crecimiento en el gastrópodo comercial abalón rojo (Haliotis rufescens). A partir de EST anotados para estos genes obtenidos desde GenBank y de una biblioteca de cDNA secuenciada por pirosecuenciación 454, se diseñaron partidores específicos para su análisis por qPCR en grupos de individuos con tasas de crecimiento diferencial. Los resultados obtenidos muestran que lustrin A tiene un mayor nivel de expresión en individuos con lenta tasa de crecimiento mientras tanto ferritina y ODC presenta una mayor expresión en individuos con rápida tasa de crecimiento. Adicionalmente se evaluó la expresión de estos genes en diferentes tejidos presentando lustrin A y ODC una sobreexpresión en manto, mientras que ferritina en branquias. Los resultados obtenidos en el presente trabajo sugieren la utilización de los genes lustrin A, ferritina y ODC como potenciales marcadores moleculares asociados a crecimiento en H. rufescens.
Evaluación de la expresión génica de Factor de Necrosis Tumoral alfa e Interferón gamma, como bioindicadores del estado sanitario del salmón del Atlántico.
Autor: Paulina Lincoñil Campos
Profesor: Dra. Maria E. Cabrejos M (Aquainnovo)
RESUMEN
El cultivo de salmónidos en nuestro país ha tenido un notable crecimiento productivo, que ha sido potenciado por múltiples factores. Sin embargo, como todo cultivo masivo se presentan patógenos que afectan a los organismos; por esto, es de gran importancia contar con un método que determine tempranamente el estado sanitario de los peces para tomar medidas preventivas evitando la propagación del patógeno. La evaluación de moléculas del sistema inmune puede ser considerada como una herramienta que refleja el estado sanitario de los peces, ya que cuando se encuentran cursando un cuadro infeccioso, se produce un aumento en la expresión de ciertas proteínas que participan en la respuesta del sistema inmune del huésped contribuyendo a la defensa. Se eligieron dos proteínas con estas características para evaluar diferencias de expresión génica: Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNFα) e Interferon gamma (IFNγ). A partir de muestras de riñón anterior de Salmo salar obtenidas a partir de un desafío del virus de la Anemia Infecciosa del Salmón (ISAV) por cohabitación, se determinó la expresión relativa de ambos genes mediante la técnica Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcriptasa Reversa (RT-PCR) tiempo real. Se estableció la expresión en organismos sobrevivientes y muertos frente al desafío, obteniéndose diferencias significativas para ambos genes en los individuos sobrevivientes, pero no en los organismos muertos; excepto para IFNγ en el cual los organismos muertos tuvieron un ligero aumento en relación a los sanos. Estos resultados sugieren que los organismos sobrevivientes deben su condición a la sobreexpresión de genes relacionados con la respuesta del sistema inmune.
Caracterización parcial del ARNm del inhibidor de serin proteasa – tipo kazal en Mesodesma donacium (Lamarck 1818) y patrones de expresión en respuesta a Vibrio anguillarum
Autor: Waleska Maldonado Aguayo
Profesor: Dr. Cristian Gallardo Escarate. (crisgallardo@udec.cl)
RESUMEN
Mesodesma donacium es un bivalvo de importancia comercial en Chile y cuyas poblaciones naturales han disminuido drásticamente debido a la sobreexplotación y eventos climatológicos como el fenómeno del niño. A pesar de su relevancia económica, estudios genómicos que permitan conocer aspectos críticos como la resistencia a patógenos de esta especie son escasos. El objetivo del presente estudio fue caracterizar parcialmente el ARNm de dos inhibidores de serin proteasa (ISP) de tipo kazal en M. donacium y evaluar su asociación con inmunidad innata. Para la caracterización de los mRNAs se diseñaron partidores sobre contig anotados para ISP obtenidos desde una biblioteca de cDNA para M. donacium. Para determinar la participación de MdIsp en inmunidad, ejemplares desafiados contra V. anguilarum fueron utilizados para medir expresión a las 2-4-6-8-22 y 32 horas post infección mediante qPCR. Dos secuencias correspondientes a los contigs MdIsp8873 y MdIsp3594 mostraron un marco abierto de lectura de 511 y 279 pb codificantes para un polipéptido de 170 y 59 aminoácidos respectivamente y un péptido señal para MdIsp8873. La secuencia traducida presenta 6 cisteínas conservadas entre los inhibidores de tipo kazal, responsables de la formación de puentes disúlfuro. El análisis de expresión de MdIsp8873 mediante qPCR revela mayor expresión en manto, por sobre pie, branquia y músculo (p<0.05) mientras que MdIsp3594 presenta mayor expresión en Pie. La expresión temporal del MdIsp en individuos post infección, registró un peak a las 2 horas para MdIsp8873 (p<0.05) y 8 horas para MdIsp3594 (p<0.05). La similitud de estas secuencia con otros inhibidores de tipo kazal, además de los resultados obtenidos por qRT-PCR sugieren que MdIsp está involucrado en la respuesta inmune innata de este bivalvo. Estudios futuros deben enfocarse en la implementación de este tipo de herramientas moleculares para la detección temprana de patógenos que afectan la actividad acuícola.
Diversidad de bacterias fotótrofas anoxigénicas de ambientes termales del Altiplano Chileno: un primer paso en la búsqueda de nuevas sustancias bioactivas para la acuicultura.
Autor: Giannina Maya Hun
Profesor: Dra. Martha Hengst L (Universidad de Antofagasta)
RESUMEN
Chile, contribuye con más del 20% de la producción mundial de salmón y truchas, y ocupa el segundo lugar después de Noruega. Estas, son especies introducidas en Chile y son producidas en cultivos en balsas jaulas, principalmente al Sur de Puerto Montt. El cultivo masivo de especies en espacios confinados, trae consigo diversos efectos nocivos tanto para los animales como para los ecosistemas que los albergan. En este sentido la acuicultura representa un desafío para el equilibrio natural en el medio circundante a corto, mediano y largo plazo, generando aportes significativos en materia orgánica y antibióticos sintéticos, ambos acompañados al alimento. El uso excesivo de antibióticos sintéticos en acuicultura, ha generado el desarrollo de microorganismos multi-resistentes, que constituyen un riesgo tanto para los animales en cultivos como para la salud de las personas. Actualmente múltiples esfuerzos son dirigidos a la búsqueda de productos naturales en reemplazo de los antibióticos sintéticos tradicionales cuyos atributos principales deben ser efectividad, corta vida media y alta especificidad. Los microorganismos constituyen la fuente más promisoria en la búsqueda de antimicrobianos naturales tanto por su diversidad como por su sustentabilidad en producción masiva a nivel industrial. Aunque los océanos han sido los ambientes más explorados hasta ahora, nuevos hábitats están siendo estudiados. El Altiplano Chileno, ofrece condiciones inigualables para la búsqueda de nuevas sustancias bioactivas ya que sus condiciones ambientales como alta irradiación (PAR, UVA, UVB), oscilación térmica de ~40ºC (día/noche), baja presión de oxígeno, escaza humedad, entre otras, contribuyen al desarrollo de microorganismos en su mayoría desconocidos para la ciencia. Lirima, es un Bofedal ubicado a 4.200 msm en la Provincia de Iquique, I Región (19º51.110`LS, 068º54.400` LO), de aguas termales y con baja actividad antropogénica, caracterizado por la presencia de tapetes microbianos dominados por bacterias pigmentadas. En este estudio, se optimizaron las condiciones de cultivo para las bacterias pigmentadas fotótrofas anoxigénicas, a través del uso de nuevos medios de cultivo enriquecidos en compuestos sulfurados, dominantes en este sitio. Se obtuvo un total de 61 aislados de Bacteria en cultivos puros. La producción de pigmentos fue usada como un indicador para la producción de sustancias bioactivas naturales, y anaranjados, marrones y rojizos fueron los pigmentos dominantes. La identificación taxonómica de los aislados bacterianos fue realizada basada en la variabilidad del gen 16S rRNA y la capacidad potencial de producir sustancias bioactivas fue obtenida mediante la detección de los marcadores moleculares PKS y NRPS. La potencialidad de los medios de cultivo diseñados en este estudio para el aislamiento de bacterias fotótrofas anoxigénicas, fue evidenciada por la presencia de al menos 5 Phyla (Actinomycetes, Bacteroidetes, Firmicutes, Alfa y Gama- Proteobacteria) y 16 géneros, de los cuales un 33% de los aislados secuenciados fueron positivos para NRPS.
Control de la formación de biopelícula de Vibrio anguillarum 3276 mediante antagonistas de autoinductor I de quórum sensign aislados desde microbiota normal de trucha arcoirirs (Oncorhynchus mykiss)
Autor: Flavia Muñoz Hermosilla
Profesor: Dr. Homero Urrutia B (hurrutia@udec.cl)
RESUMEN
Vibrio anguillarum es un patógeno oportunista responsable de la vibriosis clásica, enfermedad crónica reconocida por generar septicemia hemorrágica típica en aproximadamente 50 variedades de peces tanto de aguas cálidas como frías. En Vibrio anguillarum la formación de biopelícula es regulada por quorum sensing y se cree que esta formación es primordial en etapas tempranas de patogénesis, ya que le permite fijarse sobre la superficie de un hospedador, facilitando la entrada y difusión dentro del organismo. Basado en esto, se propone que bacterias aisladas de la microbiota normal de Truchas arcoíris (Oncorhynchus mykiss) sanas, son antagonistas a quorum sensing basado en el auto-inductor I, e inhiben la formación de biopelícula de Vibrio anguillarum 3276.
El primer objetivo del presente seminario fue encontrar en 18 cepas bacterianas aisladas desde piel, músculo e intestino de peces sanos, aquellas que ejerzan inhibición de quorum sensing y detección de AHL en cepas biosensoras. 6 de estas cepas inhibieron quorum sensing (IQS) en Chromobacterium violaceum ATCC 12472 y de estas antagonistas, una detectó AHL sobre A. tumefaciens NTL4 (pZLR4). El segundo objetivo planteado fue determinar la capacidad de inhibición de la formación de biopelícula de V. anguillarum 3276 con sobrenadantes simples y concentrados de las cepas IQS, mediante el método de formación específica de biopelículas (SBF). Para descartar que una disminución en la formación de la biopelícula se debiera a un efecto bactericida y no de inhibición de QS, se ensayó en discos con sobrenadante concentrado de las cepas IQS sobre un tapiz de V. anguillarum, no observándose halos de inhibición de crecimiento. Luego los resultados del índice SBF demostraron reducciones significativas en la formación de biopelícula del patógeno (P<0,05) con todos los sobrenadantes no concentrados y concentrados, a pesar que con este último se observó también reducción en la densidad óptica de la fase planctónica, sugiriendo que la inhibición de formación de biopelícula fue dada mayormente por un efecto tóxico. En síntesis, los resultados podrían confirmar la hipótesis planteada. Sin embargo sería de utilidad que en estudios posteriores develar la estrategia inhibidora de QS que ejercen estas bacterias para optimizar su efecto antagónico y convertirse en un viable tratamiento anti- infeccioso.
El primer objetivo del presente seminario fue encontrar en 18 cepas bacterianas aisladas desde piel, músculo e intestino de peces sanos, aquellas que ejerzan inhibición de quorum sensing y detección de AHL en cepas biosensoras. 6 de estas cepas inhibieron quorum sensing (IQS) en Chromobacterium violaceum ATCC 12472 y de estas antagonistas, una detectó AHL sobre A. tumefaciens NTL4 (pZLR4). El segundo objetivo planteado fue determinar la capacidad de inhibición de la formación de biopelícula de V. anguillarum 3276 con sobrenadantes simples y concentrados de las cepas IQS, mediante el método de formación específica de biopelículas (SBF). Para descartar que una disminución en la formación de la biopelícula se debiera a un efecto bactericida y no de inhibición de QS, se ensayó en discos con sobrenadante concentrado de las cepas IQS sobre un tapiz de V. anguillarum, no observándose halos de inhibición de crecimiento. Luego los resultados del índice SBF demostraron reducciones significativas en la formación de biopelícula del patógeno (P<0,05) con todos los sobrenadantes no concentrados y concentrados, a pesar que con este último se observó también reducción en la densidad óptica de la fase planctónica, sugiriendo que la inhibición de formación de biopelícula fue dada mayormente por un efecto tóxico. En síntesis, los resultados podrían confirmar la hipótesis planteada. Sin embargo sería de utilidad que en estudios posteriores develar la estrategia inhibidora de QS que ejercen estas bacterias para optimizar su efecto antagónico y convertirse en un viable tratamiento anti- infeccioso.
Búsqueda de moléculas bioactivas presentes en hongos marinos en la desembocadura del río Itata, VIII región, Chile.
Autor: María José Oyarzo Cañete
Profesor: Dr. Mario Silva O. (mjsilva@udec.cl)
RESUMEN
Los medicamentos de la medicina moderna contienen moléculas de origen natural o modificaciones de ellas. Estas moléculas provienen en un 21% desde plantas, 5% de invertebrados marinos, 25% de microorganismos. En los últimos años, la investigación de la química de los organismos marinos ha experimentado un enorme crecimiento, debido a la necesidad de nuevos modelos de compuestos que posean actividad biológica y que tengan aplicaciones farmacéuticas. A partir de esta búsqueda de organismos, se ha encontrado que un 40% de los seres vivos que cohabitan en el océano no se conocen. De ellos, los hongos marinos, ocupan una extraordinaria variedad de ambientes ampliamente distribuidos en el fondo oceánico, colonizando de diferentes formas según sus necesidades y son reconocidos como una fuente valiosa de nuevos metabolitos secundarios con importante bioactividad.
Por las razones expuestas, este trabajo se ha dividido en dos etapas:
I.- La primera etapa, corresponde a la colección de muestras desde cuatro estaciones de la desembocadura del río Itata. A partir de sedimento marino, se obtuvo aproximadamente unas 49 cepas fúngicas. Luego se procedió al aislamiento de hongos, cultivo, fermentación, separación de compuestos polares y apolares y obtención extractos puros. Posteriormente, se midió la actividad antibacteriana frente a bacterias como E. coli y S. aureus. Se obtuvo un catastro de 16 extractos activos. Además se realizó la concentración mínima inhibitoria (CMI) a niveles inferiores a 20μg/ml. La actividad antifúngica fue estandarizada para obtener patrones de actividad. Asimismo, se vio el potencial citotóxico de los extractos polares frente modelos celulares cancerígenos en células de neuroblastoma de ratón (N2a), mediante la utilización de un ensayo colorimétrico MTT.
II.- En la segunda etapa, se realizó la extracción de los metabolitos secundarios, moléculas bioactivas, mediante diversos métodos químicos de separación y caracterización por métodos cromatográficos incluyendo el High performance Liquid Chromatography (HPLC). De este modo, se obtuvo extractos de hongos de sedimento marino, que posean diferentes tipos de actividad biológica, que ataquen a organismos patógenos con concentraciones mínimas inferiores a 50μg/ml y que se puedan cultivar en biorreactores para producir mayor cantidad de metabolitos secundarios, determinar, dentro de las restricciones, qué tipo de moléculas son, buscar una aplicación farmacológica y potenciar las propiedades bioactivas de las moléculas en diferentes áreas, orientado siempre a la biotecnología marina.
Por las razones expuestas, este trabajo se ha dividido en dos etapas:
I.- La primera etapa, corresponde a la colección de muestras desde cuatro estaciones de la desembocadura del río Itata. A partir de sedimento marino, se obtuvo aproximadamente unas 49 cepas fúngicas. Luego se procedió al aislamiento de hongos, cultivo, fermentación, separación de compuestos polares y apolares y obtención extractos puros. Posteriormente, se midió la actividad antibacteriana frente a bacterias como E. coli y S. aureus. Se obtuvo un catastro de 16 extractos activos. Además se realizó la concentración mínima inhibitoria (CMI) a niveles inferiores a 20μg/ml. La actividad antifúngica fue estandarizada para obtener patrones de actividad. Asimismo, se vio el potencial citotóxico de los extractos polares frente modelos celulares cancerígenos en células de neuroblastoma de ratón (N2a), mediante la utilización de un ensayo colorimétrico MTT.
II.- En la segunda etapa, se realizó la extracción de los metabolitos secundarios, moléculas bioactivas, mediante diversos métodos químicos de separación y caracterización por métodos cromatográficos incluyendo el High performance Liquid Chromatography (HPLC). De este modo, se obtuvo extractos de hongos de sedimento marino, que posean diferentes tipos de actividad biológica, que ataquen a organismos patógenos con concentraciones mínimas inferiores a 50μg/ml y que se puedan cultivar en biorreactores para producir mayor cantidad de metabolitos secundarios, determinar, dentro de las restricciones, qué tipo de moléculas son, buscar una aplicación farmacológica y potenciar las propiedades bioactivas de las moléculas en diferentes áreas, orientado siempre a la biotecnología marina.
Evaluación del efecto de bacterias de la microbiota del salmón del atlántico (Salmo salar) sobre el sistema inmune innato en peces, utilizando como modelo experimental peces cebra axénicos.
Autor: Carolina Ramírez Saavedra
Profesor: Dr. Jaime Romero (INTA)
RESUMEN
El desarrollo de la salmonicultura en Chileha sido contrastado por el desarrollo de enfermedades infecto contagiosas. Si bien existen medidas de control como el uso de antibióticos o de vacunas, persisten las pérdidas de la industria asociadas a estas enfermedades.Una de las alternativas para contrarrestar las patologías/infecciones puede serla manipulación de la microbiota de los peces, ya que estos microorganismos son inócuos y conviven naturalmente con su hospedero sin provocarle daño, más aún pueden tener beneficios como la estimulación del sistema inmune y la competencia con patógenos. Por esta razón se evaluaron diversos componentes de la microbiota de salmones de modo de establecer cuáles de ellos pueden aportar a la protección vía estimulación del sistema inmune innato. De esta forma, se evaluó la expresión de genes asociados a la inmunidad innata, como por ejemplo, la estimulación de las citoquinas proinflamatorias, TNFα e IL-1β, y de genes asociados a la activación del sistema inmune innato como proteína amiloide del suero, lisozima, y mieloperoxidasa, frecuentemente relacionada con la activación de neutrófilos.Para ello fue necesario la utilización de un modelo experimental axénico, de modo de eliminar las bacterias propias del modelo experimentaly por tanto, su intervenciónen las respuestas del sistema inmune de las bacterias en estudio.Así, la respuesta generada por los distintos génerosbacterianos analizados sobre el sistema inmune de larvas de pez cebra indicó que cada bacteria induce un perfil particular sobre la expresión de genes.De los seis géneros bacterianos analizados, el género Stenotrophomonassobresalió delresto, estimulando la totalidad de los genes analizados. Esto reflejaría que este género bacteriano posee una mayor capacidad de interacción con los tejidos de las larvas. Por tanto, lautilización del género Stenotrophomonasayudaría en la protección a enfermedades de origen bacteriano en peces.
Degradación de raxorsona por consorcio bacteriano anaeróbico, aislado desde fecas de pollo broiler
Autor: Rodrigo Riquelme Espinoza
Profesor: Dra. María Angélica Mondaca J. (mmondaca@udec.cl)
RESUMEN
La roxarsona (3-Nitro-4hidroxilfenilarsenico) es un compuesto organoarsenical, utilizado en la avicultura, como suplemento alimenticio en la producción de pollos broiler, principalmente como promotor del crecimiento. Este compuesto es excretado sin cambios desde los pollo al ambiente, generando un aumento de arsénico inorgánico, es por esto que se hace necesaria la búsqueda de agentes bioremediadores, con el fin de tratar sitios impactados por este compuesto.
A raíz de esta problemática se planteó como objetivo principal la selección de un consorcio bacteriano anaeróbico con capacidad de transformar roxarsona.
M1, M2 y M3 provenientes de fecas de pollo, fueron enriquecidas en un medio químicamente definido y se evaluó su capacidad degradativa de roxarsona y la cinética de crecimiento en presencia del compuesto bajo condiciones anaeróbicas. La identificación del consorcio seleccionado se realizó mediante la amplificación del gel ADNr 16S. La presencia de As inorgánico se determino mediante la técnica de Nitrato de Plata (AgNO3).
Los resultados obtenidos demostraron que M1, M2 y M3 poseen actividad degradadora de roxarsona, después 7 días de incubación, M3 alcanzó una degradación de un 76.3%, siendo la muestra seleccionada por presentar mayor porcentaje de degradación en comparación con M1 y M2. El análisis molecular demostró que el consorcio seleccionado en presencia de roxarsona cambia su estructura. La determinación de As inorgánico demostró que la roxarsona transformada libera AsV.
La proyección de esta investigación en base a los datos obtenidos es la implementación de un sistema de tratamiento biológico, de extracción de arsénico inorgánico y así, de esta forma permitir la utilización en agricultura de los fertilizantes producto de la actividad avícola en la producción de pollos broiler.
A raíz de esta problemática se planteó como objetivo principal la selección de un consorcio bacteriano anaeróbico con capacidad de transformar roxarsona.
M1, M2 y M3 provenientes de fecas de pollo, fueron enriquecidas en un medio químicamente definido y se evaluó su capacidad degradativa de roxarsona y la cinética de crecimiento en presencia del compuesto bajo condiciones anaeróbicas. La identificación del consorcio seleccionado se realizó mediante la amplificación del gel ADNr 16S. La presencia de As inorgánico se determino mediante la técnica de Nitrato de Plata (AgNO3).
Los resultados obtenidos demostraron que M1, M2 y M3 poseen actividad degradadora de roxarsona, después 7 días de incubación, M3 alcanzó una degradación de un 76.3%, siendo la muestra seleccionada por presentar mayor porcentaje de degradación en comparación con M1 y M2. El análisis molecular demostró que el consorcio seleccionado en presencia de roxarsona cambia su estructura. La determinación de As inorgánico demostró que la roxarsona transformada libera AsV.
La proyección de esta investigación en base a los datos obtenidos es la implementación de un sistema de tratamiento biológico, de extracción de arsénico inorgánico y así, de esta forma permitir la utilización en agricultura de los fertilizantes producto de la actividad avícola en la producción de pollos broiler.
Detección de Pseudomonas aeruginosa en productos farmacéuticos y materias primas mediante PCR incorporando la utilización del propidio monoazida.
Autor: Jorge Rocha Seguel
Profesor: Dr. Nelson Rojas (Laboratorio Pasteur S.A.)
RESUMEN
El proceso de control de calidad microbiológico en la industria farmacéutica requiere pruebas que confirmen la ausencia de 4 microorganismos patógenos indicadores de contaminación. De estas, Pseudomonas aeruginosa es una de las con mayor prevalencia en distintos ambientes, y debido a su ubicuidad es uno de los contaminantes microbianos más recurrentes en la industria farmacéutica. La detección de éstos se basa en metodologías clásicas dependientes de cultivo, las cuales tardan entre 5 a 7 días. No obstante, en la actualidad existen metodologías moleculares independientes de cultivo como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que permiten la obtención de resultados en menos de 30 horas. Además, es posible utilizar una metodología que incorpore la utilización del PMA previo a la extracción de ADN, evitando la aparición de falsos positivos producto de la presencia de bacterias muertas o ADN libre en la muestra.
El objetivo del presente Seminario de Título es establecer un metodología de detección para P. aeruginosa, en productos farmacéuticos y sus materias primas, mediante PCR incorporando la utilización del PMA para la eliminación de falsos positivos. Para esto se estableció una metodología basada en la extracción y purificación de ADN bacteriano desde materias primas o productos terminados de la industria farmacéutica. Se utilizó partidores especie-específicos para la detección de los marcadoras moleculares ITS ADNr 16s-23s y los genes ecfX y gyrB, en P. aeruginosa.
En el presente seminario de título se implementó una nueva metodología, basada en un procedimiento que permitió eliminar los inhibidores de la PCR presentes en los productos analizados, se desarrolló un procedimiento de extracción de ADN eficaz y eficiente, y se implementó un procedimiento que permita suprimir la presencia de falsos positivos durante la amplificación por PCR. De acuerdo con esto se determinó que la sensibilidad del método propuesto logro un límite de detección menor a 10 UFC por gramo (o mL) de muestra o alrededor de 1,5 ng de ADN, demostrando que es un método rápido, sensible, eficaz y costo-efectivo para la detección del patógeno bacteriano P. aeruginosa, capaz de responder a los estándares de calidad requeridos por la Industria Farmacéutica.
El objetivo del presente Seminario de Título es establecer un metodología de detección para P. aeruginosa, en productos farmacéuticos y sus materias primas, mediante PCR incorporando la utilización del PMA para la eliminación de falsos positivos. Para esto se estableció una metodología basada en la extracción y purificación de ADN bacteriano desde materias primas o productos terminados de la industria farmacéutica. Se utilizó partidores especie-específicos para la detección de los marcadoras moleculares ITS ADNr 16s-23s y los genes ecfX y gyrB, en P. aeruginosa.
En el presente seminario de título se implementó una nueva metodología, basada en un procedimiento que permitió eliminar los inhibidores de la PCR presentes en los productos analizados, se desarrolló un procedimiento de extracción de ADN eficaz y eficiente, y se implementó un procedimiento que permita suprimir la presencia de falsos positivos durante la amplificación por PCR. De acuerdo con esto se determinó que la sensibilidad del método propuesto logro un límite de detección menor a 10 UFC por gramo (o mL) de muestra o alrededor de 1,5 ng de ADN, demostrando que es un método rápido, sensible, eficaz y costo-efectivo para la detección del patógeno bacteriano P. aeruginosa, capaz de responder a los estándares de calidad requeridos por la Industria Farmacéutica.
Caracterización de bacterias capaces de transformar Roxarsona, en condiciones aeróbicas y su potencial aplicación biotecnológica.
Autor: Camila Saldias Gallardo
Profesor: Dr. Victor Campos A (vcampos@udec.cl)
RESUMEN
Ácido 3-nitro-4-hidroxifenilarsonico (Roxarsona), es utilizado en la alimentación de aves de corral (pollos de engorde), para el control de la coccidiosis y como promotor de crecimiento. Durante muchos años las fecas de pollo (guano) han sido utilizados como fertilizantes en la industria avícola. La Roxarsona contenida en dichos desechos es transformada por microorganismos presentes en el tracto gastrointestinal y fecas de pollos de un compuesto organoarsenical a especies inorgánicas del arsénico, altamente tóxicos, (arsenito As3+ y arsenato As5+), llegando fácilmente a aguas superficiales y subterráneas presentando un riego para los distintos ecosistemas.
El objetivo del presente trabajo fue identificar bacterias aerobias capaces de tolerar y transformar la Roxarsona. El aislamiento de cepas de muestras de suelo agrícola fue realizado mediante placas con agar R2A con Roxarsona 0,5 mM. La determinación de tolerancia a arsenito As3+, arsenato As5+ y Roxarsona fue determinada por micro dilución con concentraciones que variaron entre 0,5; 1; 2; 4; 8 y 10 mM. Los ensayos de biotransformación se realizaron mediante espectrofotometría a una longitud de onda de 400 nm, se evaluó la capacidad de transformación por la comunidad y de las cepas aisladas.
Los ensayos de transformación de Roxarsona por la cepa C5 con diferentes fuentes de carbono fue determinada por análisis cuantitativos (espectrofotometría).
Se aislaron 9 cepas tolerantes a Roxarsona desde muestras de suelo agrícola. Los niveles de tolerancia para As3+ variaron entre 2 y 6 mM, para As5+ entre 4 y >10 mM y para Roxarsona entre 1 y 4 mM.
La cepa con mayor nivel de tolerancia y transformación fue seleccionada e identificada como Bacillus cereus.
La capacidad de formación de biopeliculas por Bacillus cereus fue estudiada mediante Microscopía Electrónica de Barrido (SEM).
Los datos experimentales demostraron la capacidad de transformación de Roxarsona por cepas aeróbicas provenientes de muestras de suelo agrícola, evidenciado por la desaparición (disminución) del color amarillo característico de Roxarsona, respaldado por los análisis cuantitativos por espectrofotometría, destacando que Bacillus cereus transformó un 77% de la concentración inicial.
El objetivo del presente trabajo fue identificar bacterias aerobias capaces de tolerar y transformar la Roxarsona. El aislamiento de cepas de muestras de suelo agrícola fue realizado mediante placas con agar R2A con Roxarsona 0,5 mM. La determinación de tolerancia a arsenito As3+, arsenato As5+ y Roxarsona fue determinada por micro dilución con concentraciones que variaron entre 0,5; 1; 2; 4; 8 y 10 mM. Los ensayos de biotransformación se realizaron mediante espectrofotometría a una longitud de onda de 400 nm, se evaluó la capacidad de transformación por la comunidad y de las cepas aisladas.
Los ensayos de transformación de Roxarsona por la cepa C5 con diferentes fuentes de carbono fue determinada por análisis cuantitativos (espectrofotometría).
Se aislaron 9 cepas tolerantes a Roxarsona desde muestras de suelo agrícola. Los niveles de tolerancia para As3+ variaron entre 2 y 6 mM, para As5+ entre 4 y >10 mM y para Roxarsona entre 1 y 4 mM.
La cepa con mayor nivel de tolerancia y transformación fue seleccionada e identificada como Bacillus cereus.
La capacidad de formación de biopeliculas por Bacillus cereus fue estudiada mediante Microscopía Electrónica de Barrido (SEM).
Los datos experimentales demostraron la capacidad de transformación de Roxarsona por cepas aeróbicas provenientes de muestras de suelo agrícola, evidenciado por la desaparición (disminución) del color amarillo característico de Roxarsona, respaldado por los análisis cuantitativos por espectrofotometría, destacando que Bacillus cereus transformó un 77% de la concentración inicial.
Thraustochytridos: un protista fungide como alternativa biotecnológica marina para la producción sustentable de ácidos Grasos poliinsaturados (PUFAs)
Autor: Cristian Socias Muñoz
Profesor: Dr. Rodrigo González S (rogonzal@udec.cl)
RESUMEN
En el año 2010 el aceite de pescado necesario para suplir las necesidades de la industria acuícola alcanzó aproximadamente a 1,2 millones de toneladas, correspondiendo a un 92% de la producción mundial. Los aceites producidos por los Thraustochytridos son una alternativa al de pescado, ya que tienen la capacidad de sintetizar PUFAs de novo, específicamente DHA. Estos microorganismos se encuentran ampliamente distribuidos en diferentes ambientes marinos del planeta. En este trabajo se investigó la presencia de estos protistas fungoides en la costa de la región del Bío Bío (Chile Central) y Canal Puyuhuapi, (Chile Sur Austral). Se utilizó una estrategia basada en el aislamiento con polen de pino, cultivo en medio sólido, amplificación de la subunidad menor del ARN ribosomal (18S rDNA) y una comparación bioínformática con cepas altamente productoras de PUFAs ω3 (DHA). De un total de 81 cepas aisladas, desde los dos ecosistemas marinos estudiados, que presentaron las características morfológicas de los Thraustochytridos, 25 fueron seleccionadas de acuerdo a su pigmentación y área geográfica, de las cuales 17 fueron secuenciadas con éxito. 15 de las cepas aisladas desde ambos ecosistemas presentan un 89% de similitud genética con Schizochytrium sp. KH105, cepa que tiene una alta la capacidad de producir DHA y pigmentos carotenoides, ambas características de interés para la biotecnología marina. Finalmente el cepario construido con los Thraustochytridos captados desde los dos ecosistemas marinos estudiados en este trabajo, así como también las cepas asiladas que presentan una gran similitud genética con aquellos descritos como de interés biotecnológico, demuestra la existencia de un sustrato microbiano en el área marina del Centro y Sur Austral de Chile que es potencialmente desarrollable como una alternativa sustentable para la producción de PUFAs y carotenoides, ambas sustancias de notable interés comercial para la industria acuícola, de alimentos y farmacológica, entre otras.
Detección del virus de la hepatitis A (VHA) en organismos marinos y otras matrices.
Autor: Luis Soto Godoy
Profesor: Dr. Rodrigo González S (rogonzal@udec.cl)
RESUMEN
Se ha observado que organismos filtradores son bioacumuladores de Norovirus, así como también del virus de la hepatitis A (VHA). Por lo tanto, la certificación de productos pesqueros posee gran importancia para su comercialización, sobre todo a nivel internacional. El VHA es un patógeno que afecta principalmente al hígado humano siendo su principal vía de transmisión la contaminación fecal. En el ambiente, el virus puede permanecer activo durante un mes. El objetivo de este trabajo fue desarrollar una técnica molecular para la detección del VHA desde muestras de moluscos bivalvos y microplancton mediante la amplificación de un segmento de la región 5´NCR del virus. Para abordar esta tarea se analizaron 146 muestras proveniente de la región del Bío Bío, utilizando métodos de extracción de ARN, transcripción inversa (ADNc), amplificación por PCR convencional, clonación y secuenciación de las muestras positivas. Los resultados indican que mediante el método desarrollado fue posible detectar la región 5´NCR del VHA en muestras de hepatopáncreas de Perumytilus purpuratus obtenidos directamente desde el ambiente, a diferencia del análisis realizado en moluscos bivalvos obtenidos del comercio establecido y en muestras de microplancton donde los resultados fueron negativos. Las secuencias de un fragmento de la región 5´NCR obtenidas de las muestras positivas indican que el ARN detectado pertenecería al genotipo Ib del VHA, reportado sólo para Brasil en Latinoamérica. La detección de VHA en las muestras provenientes del Puerto de Lirquén es consistente con la presencia de un emisario sub-marino que entrega aportes de material fecal al área y constituye una señal de alerta sobre la existencia de un reservorio latente en el ecosistema marino para contraer esta enfermedad. Finalmente este trabajo aporta un método para la detección molecular de VHA en productos pesqueros y corresponde al primer paso para entender la dinámica ambiental de este virus en la costa de la región del Bío Bío u otro ecosistema marino susceptible a ser estudiado.
Estandarización de un bioensayos respirométrico en Branchionus sp. utilizando sondas ópticas fluorescentes para la medición de efectos tóxicos subletales, frente al metal pesado Cadmio (Cd).
Autor: Francisca Valenzuela Aguayo
Profesor: Dr. Renato Quiñones B (rquinone@udec.cl)
RESUMEN
La tasa de consumo de oxígeno es un marcador biológico universal y sensible a la viabilidad y estado metabólico de organismos aeróbicos. Desde hace aproximadamente una década se están desarrollando nuevas metodologías para la obtención de pruebas rápidas y de alto rendimiento para la comprobación de efectos tóxicos potencialmente peligrosos basada en la medición del consumo de oxígeno de organismos acuáticos mediante sondas fluorescentes sensibles a esta molécula, las que son detectadas mediante un lector de placas fluorescente. En el presente estudio se desarrolló un bioensayo respirométrico de toxicidad aguda frente a Cadmio (Cd) en Brachionus sp. utilizando sondas ópticas Mitoxpress® para el consumo de oxígeno. Se expusieron al tóxico ejemplares de Brachionus sp. para conocer el número de organismos recomendable para este bioensayo, la concentración de sonda adecuada al organismo y la tasa de consumo de oxígeno al ser sometidos a diferentes concentraciones de Cd (CL1, CL10, CL50 y CL90) en relación con los controles no tratados. La CL50-24 h determinada mediante bioensayos tradicionales para Brachionus sp. frente a Cadmio fue de 68.6 mg L -1. La tasa de consumo de oxígeno individual de hembras sin huevos del rotífero Brachionus sp. determinada mediante el uso del Respirómetro YSI 5300 A, fue de 0,20 x 10-5 ml O2 h-1 ind.-1 a 25°C. El número óptimo de organismos a utilizar para el bioensayo respirométrico con sonda Mitoxpress® fue de 50 individuos/75μl de medio con una concentración de sonda 0,5 μM. En cuanto a la variación de la tasa respiratoria de los organismos en relación a la concentración de Cd, se observó una disminución de la fluorescencia al aumentar la concentración del tóxico, lo que representa una relación inversa entre la tasa de consumo de oxígeno y la concentración de Cd. Este ensayo es la primera aproximación en el uso del modelo rotíferos/consumo de oxígeno mediante sondas fluorescentes en ensayos de toxicidad.