Autor: Autor: Natalia Belmar Sazo.
Profesor Tutor: Profesor: Dr. Juan Carlos Vera Cárcamo.
Laboratorio de Antioxidantes. Universidad de Concepción, Concepción
Laboratorio de Antioxidantes. Universidad de Concepción, Concepción
RESUMEN
La acuicultura de salmónidos se encuentra regularmente preocupada de optimizar el
crecimiento, calidad y la obtención de una alta productividad de especies de cultivo. Por este
motivo es que cada vez se hace más relevante la necesidad de mantener a los salmónidos con
buena salud, enfocándose en reforzar su defensa contra distintos patógenos y fortaleciendo su
inmunidad innata. Para esto se utilizó por mucho tiempo una cantidad excesiva de antibióticos, lo que luego por motivos ambientales, y por adquisición de resistencia a los patógenos se disminuyó y en muchos casos eliminó. A razón de lo anterior se han implementado distintas formas para mejorar la inmunidad innata de los peces, por ejemplo disminuyendo el estrés que implica la acuicultura intensiva. Varios estudios demuestran que la alimentación y específicamente la dosis con vitamina C producen mejoras en la salud y defensa de los peces.
Por el contrario deficiencias de vitamina C provoca hemorragias, escoliosis entre otras
enfermedades.
Algunos peces, entre ellos especies de salmonídeos, no tienen la capacidad de sintetizar
vitamina C, ya que no poseen la enzima L-gulonolactona oxidasa capaz de catalizar la última etapa de la conversión de glucosa en vitamina C (ácido ascórbico), debiendo ser suministrado a través de la dieta. El hígado y el riñón cefálico son los órganos más importantes de almacenamiento de vitamina C en peces.
Conocemos con bastante exactitud el mecanismo de obtención de ácido ascórbico en la
mayoría de las especies de mamíferos y se han identificado molecularmente los
transportadores involucrados. Sin embargo, a pesar de la abundante información acerca de la importancia de la vitamina C en la mantención de la fisiología normal en peces, carecemos de información del mecanismo de transporte de ácido ascórbico y de la incorporación celular de la vitamina C, incluyendo la identidad de los transportadores y sus propiedades funcionales.
El efecto positivo de la suplementación con vitamina C sobre la salud y defensa de los
peces, junto a la evidencia indicando acumulación preferencial en ciertos órganos, nos permite proponer la existencia de transportadores de ácido ascórbico en peces. Proponemos que estos transportadores pertenecen a la familia de transportadores de nucleobases /ascorbato descritos en otras especies, con conservación de aspectos estructurales y funcionales.
El objetivo de este proyecto es identificar molecular y funcionalmente los
transportadores de vitamina C expresados en peces utilizando células de riñón de trucha
arcoíris (Oncorhynchus mykiss). Para identificar los transportadores, llevaremos a cabo
ensayos de amplificación de secuencias específicas por PCR. Para estudiar las propiedades
funcionales de los transportadores, realizaremos experimentos de transporte de ácido
ascórbico.
Se espera que los resultados de este proyecto entreguen la primera evidencia científica
de la existencia de transportadores de vitamina C en trucha arcoíris y permitan su
identificación molecular y funcional como miembros de la familia de transportadores de
nucleobase/ascorbato expresados en la mayoría de las especies. Estos resultados serán
fundamentales en estudios posteriores destinados a modificar productivamente el metabolismo de la vitamina C en peces para un mejor aprovechamiento de este nutriente fundamental en salmonídeos de cultivo de alta densidad.
crecimiento, calidad y la obtención de una alta productividad de especies de cultivo. Por este
motivo es que cada vez se hace más relevante la necesidad de mantener a los salmónidos con
buena salud, enfocándose en reforzar su defensa contra distintos patógenos y fortaleciendo su
inmunidad innata. Para esto se utilizó por mucho tiempo una cantidad excesiva de antibióticos, lo que luego por motivos ambientales, y por adquisición de resistencia a los patógenos se disminuyó y en muchos casos eliminó. A razón de lo anterior se han implementado distintas formas para mejorar la inmunidad innata de los peces, por ejemplo disminuyendo el estrés que implica la acuicultura intensiva. Varios estudios demuestran que la alimentación y específicamente la dosis con vitamina C producen mejoras en la salud y defensa de los peces.
Por el contrario deficiencias de vitamina C provoca hemorragias, escoliosis entre otras
enfermedades.
Algunos peces, entre ellos especies de salmonídeos, no tienen la capacidad de sintetizar
vitamina C, ya que no poseen la enzima L-gulonolactona oxidasa capaz de catalizar la última etapa de la conversión de glucosa en vitamina C (ácido ascórbico), debiendo ser suministrado a través de la dieta. El hígado y el riñón cefálico son los órganos más importantes de almacenamiento de vitamina C en peces.
Conocemos con bastante exactitud el mecanismo de obtención de ácido ascórbico en la
mayoría de las especies de mamíferos y se han identificado molecularmente los
transportadores involucrados. Sin embargo, a pesar de la abundante información acerca de la importancia de la vitamina C en la mantención de la fisiología normal en peces, carecemos de información del mecanismo de transporte de ácido ascórbico y de la incorporación celular de la vitamina C, incluyendo la identidad de los transportadores y sus propiedades funcionales.
El efecto positivo de la suplementación con vitamina C sobre la salud y defensa de los
peces, junto a la evidencia indicando acumulación preferencial en ciertos órganos, nos permite proponer la existencia de transportadores de ácido ascórbico en peces. Proponemos que estos transportadores pertenecen a la familia de transportadores de nucleobases /ascorbato descritos en otras especies, con conservación de aspectos estructurales y funcionales.
El objetivo de este proyecto es identificar molecular y funcionalmente los
transportadores de vitamina C expresados en peces utilizando células de riñón de trucha
arcoíris (Oncorhynchus mykiss). Para identificar los transportadores, llevaremos a cabo
ensayos de amplificación de secuencias específicas por PCR. Para estudiar las propiedades
funcionales de los transportadores, realizaremos experimentos de transporte de ácido
ascórbico.
Se espera que los resultados de este proyecto entreguen la primera evidencia científica
de la existencia de transportadores de vitamina C en trucha arcoíris y permitan su
identificación molecular y funcional como miembros de la familia de transportadores de
nucleobase/ascorbato expresados en la mayoría de las especies. Estos resultados serán
fundamentales en estudios posteriores destinados a modificar productivamente el metabolismo de la vitamina C en peces para un mejor aprovechamiento de este nutriente fundamental en salmonídeos de cultivo de alta densidad.
Autor: Angelo Cartes Cartes
Profesor: Dra. Allisson Astuya Villalón. Unidad de Biotecnología Marina
Universidad de Concepción, Concepción
Universidad de Concepción, Concepción
Profesor Co-Tutor: Dra. Viviana Ulloa Jofré. Unidad de Biotecnología Marina
Universidad de Concepción, Concepción
Universidad de Concepción, Concepción
RESUMEN
Con los años de investigación, la biotecnología ha puesto en el mercado variados productos con capacidad de adhesión tisular, que han sido utilizados en medicina como agentes de curación de heridas y detención del sangrado. Durante el desarrollo de los actuales adhesivos se han tratado de resolver los principales desafíos de biocompatibilidad y la mantención de la adhesión en ambientes acuosos. En la naturaleza existen varios modelos animales que se caracterizan por desarrollar potentes estrategias de adhesión a superficies en ambientes acuosos, como es el caso de los bivalvos, especialmente del género Mytilus. Este tipo de invertebrado marino ha servido de inspiración en varias investigaciones en las cuales han identificado las proteínas que participan directamente del proceso de adhesión (MAPs, por su sigla en inglés: Mussel Adhesive Proteins). Se han identificado a lo menos 5 proteínas constituyentes del biso y que participan directamente del proceso de adhesión. Estas proteínas se sintetizan y liberan desde el pie de Mytilus galloprovinciallis y los estudios han demostrado que esta fuerte adhesión es debido a la presencia del aminoácido DOPA, derivado de la hidroxilación de residuos de tirosina, y que está contenido entre 2 y 28% dentro de estas proteínas. A partir de la extracción de proteínas involucradas en el proceso de adhesión se ha determinado su utilidad como potencial bioadhesivo y por otra parte se ha demostrado la eficiencia del diseño in silico y de los sistemas procariontes de síntesis in vitro de nuevos adhesivos sintéticos a partir de estos organismos marinos. En este contexto el objetivo del presente trabajo fue sintetizar un extracto proteico recombinante con capacidad de adhesión utilizando la secuencia codificante de la proteína 3 del pie de M. galloprovincialis (Mgfp-3) y se expresó en un sistema eucarionte (células HEK-293) para evaluar la capacidad de adhesión. Se logró clonar la secuencia Mgfp-3A del pie de M. galloprovincialis, lo que fue confirmado por secuenciación. Esta secuencia fue expresada en la línea celular humana HEK-293 observando una proteína de 12 kDa, la que se sugiere podría corresponder a la proteína Mgfp-3A. Estos resultados deben ser confirmados por técnicas de identificación más específicas como Western Blot.
DETECCIÓN MOLECULAR DE ISAV Y PISCIRICKETTSIA SALMONIS, E IDENTIFICACIÓN DE ENDOPARÁSITOS EN LA ICTIOFAUNA NATIVA Y SALMÓNIDOS DE VIDA LIBRE DEL ECOSISTEMA SUR AUSTRAL DE CHILE.
Autor: Héctor Castillo Córdova.
Profesor Tutor: Dr. Fernando Cruzat Cruzat. Unidad de Biotecnología Marina
Universidad de Concepción, Concepción
Universidad de Concepción, Concepción
Profesor Co-Tutor: Dr. Rodrigo González Saldía. Unidad de Biotecnología Marina
Universidad de Concepción, Concepción
Universidad de Concepción, Concepción
RESUMEN
La salmonicultura es una de las actividades industriales más importantes del país con una cosecha de 488.468 toneladas el año 2012, cifra que sitúa a Chile como el segundo exportador mundial de salmones. Sin embargo, los agentes patógenos que afectan esta industria representan una limitante para su desarrollo y sustentabilidad. En base a los análisis existentes, se observa que los principales patógenos que afectan la producción de los centros de cultivo son la bacteria Piscirikettsia salmonis y el virus de la anemia infecciosa (ISAV). El análisis de estos microorganismos ha sido realizado extensivamente dentro de los centros de cultivo, no obstante, el conocimiento de la presencia de potenciales reservorios en ictiofauna nativa y salmónidos de vida libre que habitan zonas circundantes a las balsas jaulas es escaso. Otro punto que bien puede tener una repercusión en la economía y la salud pública es la presencia de helmintos endoparásitos en la ictiofauna nativa, cuya identificación en nuestro país tiene pocos estudios a nivel de especie, lo que limita el conocimiento de su biodiversidad.
En este trabajo se realizó la detección de ISAV y Piscirickettsia salmonis por medio de PCR en tiempo real en 24 ejemplares, correspondientes a 8 especies de ictiofauna nativa y a un salmónido de vida libre recolectados del canal Puyuhuapi, resultando negativa para los dos patógenos bajo estudio. Por otra parte, fue reportada una patología no reconocida, basada en la presencia de nódulos blancos en el hígado de los peces, principalmente de Róbalo (Eleginops maclovinus). La presencia del patógeno no identificado se detectó mediante análisis de microscopía electrónica de transmisión. Los nódulos fueron diseccionados y amplificados con partidores universales para el gen 18S ADNr, no obstante las secuencias obtenidas correspondían a las secuencias de los peces hospedadores.
Se identificaron molecularmente 3 helmintos endoparásitos hospedados en peces silvestres, que correspondían a Anisakis pegreffi en Chancharro (Helicolenus lengerichi) y Diphyllobothrium pacificum en Róbalo (Eleginops maclovinus), el hallazgo de este último genera el conocimiento del hospedador intermediario que lo alberga, ya que no había sido reportado en la ictiofauna nativa de nuestro país.
La ausencia de P. salmonis e ISAV en la ictiofauna analizada genera tranquilidad con respecto al impacto que estos patógenos de cultivo pueden generar en la pesca artesanal. Sin embargo, no se descarta ampliar el número de ejemplares analizados para detectar estas y otras
patologías, como la asociada a los nódulos blancos, la cual requiere de una pronta identificación para evitar posibles agravios a la economía acuícola del país.
En este trabajo se realizó la detección de ISAV y Piscirickettsia salmonis por medio de PCR en tiempo real en 24 ejemplares, correspondientes a 8 especies de ictiofauna nativa y a un salmónido de vida libre recolectados del canal Puyuhuapi, resultando negativa para los dos patógenos bajo estudio. Por otra parte, fue reportada una patología no reconocida, basada en la presencia de nódulos blancos en el hígado de los peces, principalmente de Róbalo (Eleginops maclovinus). La presencia del patógeno no identificado se detectó mediante análisis de microscopía electrónica de transmisión. Los nódulos fueron diseccionados y amplificados con partidores universales para el gen 18S ADNr, no obstante las secuencias obtenidas correspondían a las secuencias de los peces hospedadores.
Se identificaron molecularmente 3 helmintos endoparásitos hospedados en peces silvestres, que correspondían a Anisakis pegreffi en Chancharro (Helicolenus lengerichi) y Diphyllobothrium pacificum en Róbalo (Eleginops maclovinus), el hallazgo de este último genera el conocimiento del hospedador intermediario que lo alberga, ya que no había sido reportado en la ictiofauna nativa de nuestro país.
La ausencia de P. salmonis e ISAV en la ictiofauna analizada genera tranquilidad con respecto al impacto que estos patógenos de cultivo pueden generar en la pesca artesanal. Sin embargo, no se descarta ampliar el número de ejemplares analizados para detectar estas y otras
patologías, como la asociada a los nódulos blancos, la cual requiere de una pronta identificación para evitar posibles agravios a la economía acuícola del país.
EVALUACIÓN DEL COLÁGENO IV, LECTINA TIPO C Y METALOPROTEASA EN LA RESPUESTA INMUNE INNATA DEL ABALÓN ROJO HALIOTIS RUFESCENS
Autor: Ornella Chovar Vera
Profesor: Dr. Cristian Gallardo Escárate. Facultad de Cs. N y Oceanográficas.
Universidad de Concepción
Universidad de Concepción
RESUMEN
Como integrante de la amplia familia de colágenos se encuentra el colágeno IV. Esta proteína es el mayor componente de las membranas basales las que corresponden a matrices extracelulares (MEC) especializadas, dándose su principal función a nivel estructural, sin embargo existe evidencia que señala un posible rol estimulador de la respuesta inmune innata en invertebrados, principalmente mediante los péptidos generados al ocurrir la proteólisis de las MEC llamados matrikinas. El presente estudio posee como objetivo evaluar la participación de los péptidos generados de Colágeno IV en el sistema inmune innato de Haliotis rufescens. Adicionalmente, las matrikinas pueden formarse a partir de daño tisular generado por la acción de patógenos como también por remodelación de los tejidos mediante la participación de metaloproteinasas (MMPs). De esta forma se evaluó la expresión de MMP-1 conjuntamente con la expresión de Lectina C, proteína que tiene como principal función el reconocimiento de los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs). La expresión de estos genes en diferentes tejidos así como su respuesta frente al patógeno Vibrio anguillarum fue determinada a 3, 6, 12 y 24 horas post inyección. El análisis de expresión de Colágeno IV mostró una mayor expresión en tejido muscular por sobre lo obtenido en branquia (p< 0.05), mientras que Lectina tipo C contó con una menor expresión en tejido muscular y en tejido branquial esta fue mayor pero presentó una alta desviación estándar. La expresión temporal mostrada en los individuos post inyección con V. anguillarum presento un aumento en la hora 6 en el caso de Colágeno IV y MMPs, mientras que para Lectina C este se observó a las 12 horas. Los resultados obtenidos sugieren que colágeno IV está involucrado en la respuesta inmune innata de Haliotis rufescens.
Evaluación in vitro de la actividad antibacteriana de extractos de líquenes antárticos sobre patógenos con importancia en acuicultura.
Autor: Marcela Espinoza Nancabil.
Profesor Tutor: Dr. Gerardo González – Rocha
Departamento de Microbiología. Universidad de Concepción, Concepción
Departamento de Microbiología. Universidad de Concepción, Concepción
Profesor Co-Tutor: Dra. Angélica Casanova – Katny
Departamento de Microbiología. Universidad de Concepción, Concepción
Departamento de Microbiología. Universidad de Concepción, Concepción
RESUMEN
Es indudable que la acuicultura, en especial la salmonicultura, ha gozado de una espectacular atención y desarrollo a nivel mundial durante los últimos años, convirtiéndose en una de las actividades con mayor futuro económico. Para lograr la sustentabilidad de esta área se hace necesario intensificar los cultivos, valiéndose de tecnología avanzada y que sea aplicable, así como también, hacer frente a los diversos problemas que afectan actualmente esta actividad, entre los que destacan el incremento de las enfermedades infecciosas.
En la actualidad existen diferentes alternativas de tratamiento para estas enfermedades, como son el uso de vacunas, probióticos, inmunoestimulantes, etc. Sin embargo, principalmente son tratadas con antibióticos, que en algunas ocasiones su uso es excesivo. Esto ha llevado a una discusión nacional e internacional, por los nocivos efectos secundarios que estos productos causan al ambiente y a la salud pública, pero esencialmente el impacto que causan en los patógenos que producen estas enfermedades, ya que se ha demostrado que un aumento del consumo de antibióticos conlleva una selección de bacterias resistentes, trayendo como consecuencia que los tratamientos se han vuelto poco efectivos. El uso profiláctico de antibióticos en la industria de los agronegocios y en la acuicultura está dirigido a prevenir infecciones en poblaciones de animales altamente susceptibles a la infección producidas por condiciones de hacinamiento, manipulación y problemas dietéticos en su crianza; sin embargo, existe evidencia epidemiológica y molecular que este uso es la principal causa de la evolución de las bacterias resistentes a los antibióticos que producen las enfermedades humanas y animales en muchos países. En Chile, en la industria salmonera se utiliza para producir una tonelada de salmón aproximadamente 75 veces más antibióticos que en Noruega, lo que ha llevado a la detección de residuos en los alimentos producidos por estas industrias y consumidos en el país, factor que probablemente más influencia en la evolución de las bacterias resistentes. Por lo anterior surge la necesidad imperiosa de la búsqueda de nuevos compuestos con actividad antibacteriana y que no produzcan necesariamente la presión selectiva que están ejerciendo los antibióticos actuales.
En la actualidad existen diferentes alternativas de tratamiento para estas enfermedades, como son el uso de vacunas, probióticos, inmunoestimulantes, etc. Sin embargo, principalmente son tratadas con antibióticos, que en algunas ocasiones su uso es excesivo. Esto ha llevado a una discusión nacional e internacional, por los nocivos efectos secundarios que estos productos causan al ambiente y a la salud pública, pero esencialmente el impacto que causan en los patógenos que producen estas enfermedades, ya que se ha demostrado que un aumento del consumo de antibióticos conlleva una selección de bacterias resistentes, trayendo como consecuencia que los tratamientos se han vuelto poco efectivos. El uso profiláctico de antibióticos en la industria de los agronegocios y en la acuicultura está dirigido a prevenir infecciones en poblaciones de animales altamente susceptibles a la infección producidas por condiciones de hacinamiento, manipulación y problemas dietéticos en su crianza; sin embargo, existe evidencia epidemiológica y molecular que este uso es la principal causa de la evolución de las bacterias resistentes a los antibióticos que producen las enfermedades humanas y animales en muchos países. En Chile, en la industria salmonera se utiliza para producir una tonelada de salmón aproximadamente 75 veces más antibióticos que en Noruega, lo que ha llevado a la detección de residuos en los alimentos producidos por estas industrias y consumidos en el país, factor que probablemente más influencia en la evolución de las bacterias resistentes. Por lo anterior surge la necesidad imperiosa de la búsqueda de nuevos compuestos con actividad antibacteriana y que no produzcan necesariamente la presión selectiva que están ejerciendo los antibióticos actuales.
Diagnóstico y genotipificación del virus de la Necrosis Pancreática infecciosa (IPNv) en salmónidos cultivados usando la técnica combinada de RT-PCR tiempo real y Universal Probe Library (UPL)
Autor: Claudia Fernández Caro
Profesor: Dr. Rubén Avendaño Herrera
Laboratorio de Patología de Organismos Acuáticos y Biotecnología Acuícola.
Universidad Andrés Bello, Sede Viña del Mar
Laboratorio de Patología de Organismos Acuáticos y Biotecnología Acuícola.
Universidad Andrés Bello, Sede Viña del Mar
RESUMEN
El virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNv), es el agente etiológico de la enfermedad del mismo nombre, el cual afecta principalmente a trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) y salmón del Atlántico (Salmo salar), alcanzando en el 2012 mortalidades de un 21,8%. La virulencia de IPNv ha sido atribuible a su variación genética en el segmento A, ya que el virus puede modificar las vías de señalización a través de las proteínas virales codificadas en dicho segmento, incluyendo propiedades como la capacidad de manipular la maquinaria celular para facilitar la síntesis viral y así evadir la respuesta de defensa. Esta variación genética permite identificar 7 geno- y 9 sero-tipos, siendo reportados en Chile dos de ellos, West Buxton (WB) y Spajarup (Sp). Por tanto, al momento de realizar el diagnóstico no sólo es importante detectar la presencia de partículas virales sino también conocer el genotipo de IPNv. A la fecha, los métodos de diagnostico requieren del aislamiento en líneas celulares y su posterior confirmación como IPNv usando técnicas serológicas o moleculares, lo que incrementa los tiempos de análisis y la entrega de resultados. Recientemente, Callejas et al. (2012) propone un novedoso método de qRT-PCR combinado con sondas Universal Probe Library (UPL) para detectar y genotipificar IPNv a partir de cultivo celular, pero la técnica aún no ha sido validada usando peces infectados. Por tanto, el presente estudio propone evaluar el qRT-PCR con UPL utilizando muestras de tejidos de peces infectados in vivo y muestras de campo, así como determinar la sensibilidad del mismo protocolo. Los resultados muestran una alta sensibilidad (100%) en la detección de las partículas virales y confirman la especificidad en la detección de los genotipos WB y Sp, permitiendo disminuir los tiempos de análisis debido a que no se requiere del aislamiento y cultivo de IPNv.
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICÓTICA DE EXTRACTOS DE ULVA SP. Y MACROCYSTIS PYRIFERA SOBRE EL HONGO FITOPATÓGENO BOTRYTIS CINEREA..
Autor: Betzabet Garcia Solis.
Profesor Tutor: Dr. Cristian Agurto Muñoz. Laboratorio GIBMAR. Centro de Biotecnología, Universidad de Concepción Concepción-Chile
RESUMEN
En la industria frutícola, existen microorganismos fitopatógenos que afectan la productividad provocando mermas de hasta un 5% de la fruta de exportación con enormes pérdidas económicas. Buscando resolver este problema se ha encontrado que las macroalgas presentan propiedades antifúngicas, las cuales pueden estar relacionadas a diferentes metabolitos, ya sean terpenos o polisacáridos sulfatados, los cuales se encuentran presentes en macroalgas pardas, rojas y verdes. En este estudio se evaluaron extractos de Ulva sp. y Macrocystis pyrifera para el desarrollo de la investigación de las propiedades antifúngicas contra el hongo Botrytis cinerea. En el presente trabajo se determinó y evaluó la actividad antimicótica según el solvente utilizado para la extracción, en donde los extractos de Ulva sp. presentaron actividad antifúngica con acetona y acetato de etilo, no así M. pyrifera, que no mostró actividad. Además, se determinó la dilución máxima inhibitoria (DMI) de los extractos, los cuales presentaron una dilución de 1:100, en Ulva sp. de cultivo y natural, con acetona y acetato de etilo. Finalmente, se realizó una bioautografía en TLC, para detectar compuestos con actividad antimicótica, la cual no mostró resultados esperados, por lo cual, se sugiere utilizar otro método de estudio como por ejemplo GC/MS ó HPLC. Los datos correspondiente a la actividad antifúngica que se obtuvieron en esta investigación, representa gran ayuda para continuar en la línea del desarrollo del papel de alga con propiedades antibacterianas, antioxidantes y antimicóticas, propuesto en el proyecto FONDEF D11I-1226, en el cual este trabajo está inmerso.
DETERMINACION DE NIVELES BASALES DEL METABOLITO
SEM EN PECES POR HPLC/MS-MS
Autor: Nicole Jaramillo Espinoza
ProfesorSr. Luis Roa Marín. Jefe laboratorio análisis de Residuos SGS Concepción. Chile.
RESUMEN
Chile ha logrado situarse como el segundo productor mundial de salmón cultivado , después de Noruega, esto, debido a la relación de diversos factores entre los cuales destacan la importante inversión privada y características geográficas influyentes dentro de un perfil de ventajas comparativas naturales favorables al cultivo del salmón, la óptima disposición del borde costero combinado con una alta calidad del recurso agua en cuanto a temperatura, pureza y corrientes marinas, la estacionalidad inversa a la del hemisferio norte, donde se concentran los grandes mercados consumidores, otorgándole una ventaja estacional a la industria nacional respecto de sus competidores del norte, una oferta de trabajo abundante y de bajo costo relativo, oferta de materia prima abundante y bajo costo, tanto de harina y aceite de pescado (Cabello, 2004). Sin embargo este crecimiento ha estado marcado por un uso indiscriminado de antibióticos de forma profiláctica, es decir preventiva y agentes quimioterapéuticos en el intento de combatir las diversas enfermedades que caracterizan esta actividad.
El uso masivo de antibióticos en acuicultura genera una serie de repercusiones que escapan los confines geográficos y económicos de esta actividad, y que tienen la capacidad de influenciar negativamente aspectos de la salud humana y animal y el medio ambiente, en Chile se usan 75 veces más antibióticos por kilo de pez producido que en Noruega u otros países europeos (Cabello, 2003), lo que sugiere que existe una mayor higiene y eficiencia técnica en estos últimos países.
Los Nitrofuranos son agentes quimioterapéuticos sintéticos que han sido utilizados como aditivos alimentarios por décadas para tratar diversos patógenos, generalmente para tratar animales cultivados con enfermedades gastrointestinales causadas por bacterias y protozoos, y la acuicultura no es la excepción, los cuatro nitrofuranos más ampliamente utilizado en medicina veterinaria son furaltadona (FTD), furazolidona (FZD), nitrofurantoína (NFT) y nitrofurazone (NFZ) (Cañada et al., 2009).
Los animales medicados metabolizan estos nitrofuranos en sus respectivos metabolitos unidos a proteínas, 3-amino-5-morfolinometil-2-oxazolidinona (AMOZ) desde FTD, 3-amino-2-oxazolidinona (AOZ) desde FZD, 1-aminohydantoin (AHD) desde NFT y semicarbazida (SEM) de NFZ. Desde 1993, el uso de nitrofuranos ha sido prohibido en 10 animales productores de alimentos en los países de la Unión Europea (UE) (Reglamento 2901/93 (1993), debido a sus conocidos efectos mutagénicos y cancerígenos a determinadas concentraciones (Stolker et al., 2005), los programas de vigilancia de la UE se basan en la detección del metabolito.
Dar positivo a nitrofuranos en pruebas de controles en recursos acuícolas para un mercado tan exigente y riguroso como lo es el mercado europeo en el cual Chile ha intentado posicionarse, significaría pérdidas millonarias, no sólo para la empresa responsable, sino para toda la industria acuícola chilena ya que manifestaría la escasa vigilancia del uso de antibióticos prohibidos y la incompetencia de las entidades reguladoras, en resumen se traduciría en la pérdida de credibilidad y sustentabilidad de la actividad en chile, características que hoy en día son claves a la hora de posicionarse y/o mantenerse en un mercado ascendente y competitivo (Buschmann et al., 2006). Por otra parte existen diversos antecedentes que sugieren la existencia de niveles basales naturales del metabolito semicarbazida (SEM) presentes en peces en pequeñas pero detectables concentraciones, lo cual es un punto de conflicto, ya que no existe información concreta de cuanto seria este nivel basal en el caso de existir. Actualmente existen diversas técnicas analíticas que permiten la detección de estos metabolitos a concentraciones mínimas, sin embargo aún no existe información suficiente para discriminar entre un nivel basal de este metabolito y un nivel persistente debido al uso de un antibiótico prohibido, por lo cual se hace imperativo la determinación de estos. Para esto se presenta la idea de la validación de un protocolo que permita la detección y cuantificación de nitrofuranos, específicamente nitrofurazone y su metabolito SEM, basándose en la comparación en peces de vida libre los cuales no hayan tenido la posibilidad de ser medicados y peces de cultivo y subproductos, esto mediante la técnica analítica cromatografía líquida de alta presión acoplada a un detector masa-masa, contando con este protocolo y con la información acerca de este metabolito será posible tener un punto de referencia para discriminar entre un nivel basal de origen natural y uno originado por la administración de antibióticos para el tratamiento de enfermedades en animales de consumo, con lo cual podrían no solo evitarse perdidas millonarias para la industria sino que también mantener cierto prestigio en cuanto a calidad dentro del mercado
El uso masivo de antibióticos en acuicultura genera una serie de repercusiones que escapan los confines geográficos y económicos de esta actividad, y que tienen la capacidad de influenciar negativamente aspectos de la salud humana y animal y el medio ambiente, en Chile se usan 75 veces más antibióticos por kilo de pez producido que en Noruega u otros países europeos (Cabello, 2003), lo que sugiere que existe una mayor higiene y eficiencia técnica en estos últimos países.
Los Nitrofuranos son agentes quimioterapéuticos sintéticos que han sido utilizados como aditivos alimentarios por décadas para tratar diversos patógenos, generalmente para tratar animales cultivados con enfermedades gastrointestinales causadas por bacterias y protozoos, y la acuicultura no es la excepción, los cuatro nitrofuranos más ampliamente utilizado en medicina veterinaria son furaltadona (FTD), furazolidona (FZD), nitrofurantoína (NFT) y nitrofurazone (NFZ) (Cañada et al., 2009).
Los animales medicados metabolizan estos nitrofuranos en sus respectivos metabolitos unidos a proteínas, 3-amino-5-morfolinometil-2-oxazolidinona (AMOZ) desde FTD, 3-amino-2-oxazolidinona (AOZ) desde FZD, 1-aminohydantoin (AHD) desde NFT y semicarbazida (SEM) de NFZ. Desde 1993, el uso de nitrofuranos ha sido prohibido en 10 animales productores de alimentos en los países de la Unión Europea (UE) (Reglamento 2901/93 (1993), debido a sus conocidos efectos mutagénicos y cancerígenos a determinadas concentraciones (Stolker et al., 2005), los programas de vigilancia de la UE se basan en la detección del metabolito.
Dar positivo a nitrofuranos en pruebas de controles en recursos acuícolas para un mercado tan exigente y riguroso como lo es el mercado europeo en el cual Chile ha intentado posicionarse, significaría pérdidas millonarias, no sólo para la empresa responsable, sino para toda la industria acuícola chilena ya que manifestaría la escasa vigilancia del uso de antibióticos prohibidos y la incompetencia de las entidades reguladoras, en resumen se traduciría en la pérdida de credibilidad y sustentabilidad de la actividad en chile, características que hoy en día son claves a la hora de posicionarse y/o mantenerse en un mercado ascendente y competitivo (Buschmann et al., 2006). Por otra parte existen diversos antecedentes que sugieren la existencia de niveles basales naturales del metabolito semicarbazida (SEM) presentes en peces en pequeñas pero detectables concentraciones, lo cual es un punto de conflicto, ya que no existe información concreta de cuanto seria este nivel basal en el caso de existir. Actualmente existen diversas técnicas analíticas que permiten la detección de estos metabolitos a concentraciones mínimas, sin embargo aún no existe información suficiente para discriminar entre un nivel basal de este metabolito y un nivel persistente debido al uso de un antibiótico prohibido, por lo cual se hace imperativo la determinación de estos. Para esto se presenta la idea de la validación de un protocolo que permita la detección y cuantificación de nitrofuranos, específicamente nitrofurazone y su metabolito SEM, basándose en la comparación en peces de vida libre los cuales no hayan tenido la posibilidad de ser medicados y peces de cultivo y subproductos, esto mediante la técnica analítica cromatografía líquida de alta presión acoplada a un detector masa-masa, contando con este protocolo y con la información acerca de este metabolito será posible tener un punto de referencia para discriminar entre un nivel basal de origen natural y uno originado por la administración de antibióticos para el tratamiento de enfermedades en animales de consumo, con lo cual podrían no solo evitarse perdidas millonarias para la industria sino que también mantener cierto prestigio en cuanto a calidad dentro del mercado
EVALUACION DEL ARNm DE LA GLUCOSA-6-FOSFATO DESHIDROGENASA COMO BIOMARCADOR DE ESTRÉS AMBIENTAL.
Autor: Marcos Leiva Espinoza.
Profesor Tutor: Dra. Alejandra Llanos Rivera. Unidad de Biotecnología Marina. Universidad de Concepción, Concepción
Profesor Co-Tutor: Dr. Fernando Cruzat Cruzat. Unidad de Biotecnología Marina. Universidad de Concepción, Concepción
RESUMEN
Actualmente el incesante crecimiento industrial, ha aumentado de manera significativa las descargas de aguas residuales hacia los cursos de agua, descargas que podrían tener efectos negativos sobre la fauna existente en estas zonas. Estos efectos podrían estar relacionados con algún tipo de alteración de las vías metabólicas. Para identificar estas alteraciones se pueden utilizar biomarcadores bioquímicos, herramientas que mediante señales fisiológicas inducidas por un xenobiótico, reflejan una respuesta celular precoz, lo que se manifiesta como una solución al problema de la detección y evaluación de efluentes tóxicos y sus niveles subletales de toxicidad. Entre estos biomarcadores destaca el uso de la actividad de enzimas específicas.
Una de las enzimas utilizadas actualmente como biomarcador es la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH), enzima que cataliza la primera reacción de la vía de las pentosas fosfato, ruta que proporciona el NADPH utilizado para reacciones de biosíntesis, así como también para la estabilidad de la catalasa, y la preservación y regeneración de la forma reducida del glutatión. La actividad de esta enzima varía en diversas condiciones fisiológicas, tales como estrés, tipo de dieta, ayuno, situación endocrina, temperatura, etc. de tal manera que puede utilizarse como predictor de la homeostasis redox en animales de experimentación.
Debido a estos antecedentes se propuso para este estudio utilizar la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa como biomarcador de estrés ambiental a nivel subletal en larvas de Danio rerio que fueron expuestas al tóxico de referencia malathion. Se planteó como objetivo el establecer un protocolo de detección y cuantificación de los niveles de expresión de ARNm de la G6PDH.
El diseño experimental utilizó como modelo larvas de Danio rerio en etapa de absorción de vitelo (144 hpf), las cuales fueron expuestas al tóxico de referencia durante variados intervalos de tiempo, a diferentes concentraciones del tóxico, evaluándose la expresión del ARNm de la Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.
Los resultados obtenidos para la estandarización del protocolo de evaluación fueron: un número de 10 larvas por bioensayo, a las cuales se les extrae posteriormente el ARN y se evalúa la expresión del ARNm de la G6PDH, mediante la técnica de PCR en tiempo real. Nuestros resultados demuestran que existe un aumento en la expresión del ARNm de G6PDH con un tiempo de exposición de 6 horas y una concentración de tóxico de referencia de 3 ppm.
Una de las enzimas utilizadas actualmente como biomarcador es la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH), enzima que cataliza la primera reacción de la vía de las pentosas fosfato, ruta que proporciona el NADPH utilizado para reacciones de biosíntesis, así como también para la estabilidad de la catalasa, y la preservación y regeneración de la forma reducida del glutatión. La actividad de esta enzima varía en diversas condiciones fisiológicas, tales como estrés, tipo de dieta, ayuno, situación endocrina, temperatura, etc. de tal manera que puede utilizarse como predictor de la homeostasis redox en animales de experimentación.
Debido a estos antecedentes se propuso para este estudio utilizar la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa como biomarcador de estrés ambiental a nivel subletal en larvas de Danio rerio que fueron expuestas al tóxico de referencia malathion. Se planteó como objetivo el establecer un protocolo de detección y cuantificación de los niveles de expresión de ARNm de la G6PDH.
El diseño experimental utilizó como modelo larvas de Danio rerio en etapa de absorción de vitelo (144 hpf), las cuales fueron expuestas al tóxico de referencia durante variados intervalos de tiempo, a diferentes concentraciones del tóxico, evaluándose la expresión del ARNm de la Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.
Los resultados obtenidos para la estandarización del protocolo de evaluación fueron: un número de 10 larvas por bioensayo, a las cuales se les extrae posteriormente el ARN y se evalúa la expresión del ARNm de la G6PDH, mediante la técnica de PCR en tiempo real. Nuestros resultados demuestran que existe un aumento en la expresión del ARNm de G6PDH con un tiempo de exposición de 6 horas y una concentración de tóxico de referencia de 3 ppm.
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA EN FUNGOIDES MARINOS PARA EL ALIMENTO DE PECES
Autor: Carlos Leiva Mella.
Profesor Tutor: Dr. Rodrigo González Saldía. Unidad de Biotecnología Marina. Universidad de Concepción, Concepción
Profesor Co-Tutor: Dr. Fernando Cruzat Cruzat. Unidad de Biotecnología Marina. Universidad de Concepción, Concepción
RESUMEN
La principal fuente de proteína para la formulación de alimento para peces es la harina de pescado, la cual depende directamente de la captura industrial, la que se ha visto disminuida en los últimos años. Para palear la disminución de esta proteína se han utilizado harinas alternativas, las cuales poseen una baja digestibilidad y aceptación por los salmones. Es por esto que se han incorporados proteasas para facilitar la digestión del alimento.
Los fungoides marinos son microorganismos de interés biotecnológico debido a su amplia variedad de enzimas de interés comercial que producen. Además, se han planteado como una posible solución biotecnológica para aumentar la palatabilidad y digestibilidad del alimento. A partir de 129 cepas de fungoides marinos pertenecientes a la Unidad de Biotecnología Marina de la Universidad de Concepción, se determinó su actividad proteolítica. Se realizó una primera selección en medio sólido de agar suplementado con caseína, donde se seleccionaron cuatro cepas de fungoides marinos determinadas por el diámetro de un halo de hidrólisis: Penco 045, Cocholgue O46, 008-712 y Lenga C46. La cepa Lenga C46 presentó un halo de hidrólisis significativamente mayor, por lo que esta cepa fue caracterizada por pH y temperatura en medio líquido (Vishniac). A su vez, se determinó el crecimiento celular en los medio y se determinó ATP.
Los resultados de la caracterización arrojan que la mayor actividad proteolítica se obtiene a un pH 7 a 26°C. A partir del conteo celular y la medición de ATP se determinó que al tercer día de cultivo se debe realizar la cosecha de los microorganismos.
Finalmente, la cepa seleccionada se presenta como un interesante objeto de estudio para realizar ensayos en volúmenes mayores a los biorreactores utilizados en este trabajo. Este es un paso fundamental para proyectar su uso comercial, como aditivo en la formulación de alimento para peces.
Los fungoides marinos son microorganismos de interés biotecnológico debido a su amplia variedad de enzimas de interés comercial que producen. Además, se han planteado como una posible solución biotecnológica para aumentar la palatabilidad y digestibilidad del alimento. A partir de 129 cepas de fungoides marinos pertenecientes a la Unidad de Biotecnología Marina de la Universidad de Concepción, se determinó su actividad proteolítica. Se realizó una primera selección en medio sólido de agar suplementado con caseína, donde se seleccionaron cuatro cepas de fungoides marinos determinadas por el diámetro de un halo de hidrólisis: Penco 045, Cocholgue O46, 008-712 y Lenga C46. La cepa Lenga C46 presentó un halo de hidrólisis significativamente mayor, por lo que esta cepa fue caracterizada por pH y temperatura en medio líquido (Vishniac). A su vez, se determinó el crecimiento celular en los medio y se determinó ATP.
Los resultados de la caracterización arrojan que la mayor actividad proteolítica se obtiene a un pH 7 a 26°C. A partir del conteo celular y la medición de ATP se determinó que al tercer día de cultivo se debe realizar la cosecha de los microorganismos.
Finalmente, la cepa seleccionada se presenta como un interesante objeto de estudio para realizar ensayos en volúmenes mayores a los biorreactores utilizados en este trabajo. Este es un paso fundamental para proyectar su uso comercial, como aditivo en la formulación de alimento para peces.
CARACTERIZACIÓN DE LA MICROBIOTA ASOCIADA A CÁPSULAS OVÍGERAS Y TRACTO GASTROINTESTINAL DE Concholepas concholepas, Bruguiere, 1789 (“Loco”) E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS PIGMENTADAS ASOCIADAS.
Autor: Fabricio Lobera Ayavire.
Profesor Tutor: Dra. Ana Mercado Seguel. Laboratorio de Biotecnología FACIMAR.
Universidad de Antofagasta, Antofagasta
Universidad de Antofagasta, Antofagasta
RESUMEN
La gran variedad y distribución de microorganismos en los océanos ha despertado el interés científico por investigar bacterias asociadas a especies hidrobiológicas de alto valor comercial, con el fin de potenciar las actuales técnicas de cultivo y descubrir nuevos compuestos bioactivos. Diversos estudios describen la importancia de la microbiota asociada al tracto gastrointestinal, gónadas y otros tejidos, donde su presencia proporciona un pool de rutas bioquímicas que generan metabolitos beneficiosos para el desarrollo y mantenimiento de la homeostasis en el hospedador, destacando su rol en funciones metabólicas, desarrollo inmunológico, funciones estructurales y de pigmentación. En este contexto, el objetivo de este estudio fue caracterizar la microbiota asociada a cápsulas y tracto gastrointestinal de Concholepas concholepas (“Loco”) mediante técnicas independientes de cultivo e identificar bacterias pigmentadas asociadas, mediante técnicas dependientes de cultivo. Para realizar este estudio se utilizaron cápsulas e individuos adultos provenientes de la Unidad de Recirculación para Cultivos Larvales (URCL) de la Universidad de Antofagasta con los que se buscó confeccionar una biblioteca del gen ARNr 16S a partir de ADN metagenómico de cápsulas y tracto gastrointestinal, por otro lado se aislar cepas pigmentadas de tracto gastrointestinal y del contenido intracapsular de las cápsulas. Los resultados indicaron un predominio de Proteobacterias y Bacteroidetes destacando géneros como: Laktonella sp., Sulfitobacter sp., Ruegeria sp., y Roseovarius sp., para Proteobacterias; y Tenacibaculum sp., Maritimimonas sp. y Lacinutrix sp., para Bacteroidetes. En tanto, para cepas pigmentadas se aislaron 3 especies, 2 provenientes del tracto gastrointestinal, Paracoccus marcusii y Rhodococcus ruber, y una proveniente de cápsulas, Planococcus rifietoensis. Estos resultados son un aporte para la comprensión de la carga bacteriológica que rodea las cápsulas en el sistema de cultivo, y que posiblemente interactúan con las larvas. Por otro lado, en el caso de las bacterias pigmentadas, sirven como primer paso para un estudio más profundo acerca de las características y utilidades que pudieran tener en el área biotecnológica.
EFECTO DE SOBRENADANTES DE BACTERIAS DE ORIGEN ANTÁRTICO SOBRE BIOPELÍCULAS DE LISTERIA MONOCYTOGENES
Autor: Marianela Luna Martínez.
Profesor Tutor: Dr. Homero Urrutia Briones. Laboratorio de Biopelículas y Microbiología Ambiental. Universidad de Concepción, Concepción
RESUMEN
Listeria monocytogenes es una bacteria Gram positiva, que causa grandes pérdidas económicas en plantas de procesamiento de alimentos y problemas de salud a sus consumidores. Esta bacteria, es capaz de formar biopelículas, logrando persistir durante años en diferentes superficies. La causa de su persistencia ha sido asociada a factores como resistencia, tolerancia, estructura de la biopelícula o una incorrecta higienización. Una alternativa para erradicar la persistencia son compuestos naturales específicos para degradar la matriz de la biopelícula producidos por bacterias de la Antártica. Por lo cual, el objetivo de este trabajo fue obtener al menos un sobrenadante, de bacterias aisladas de la Antártica, con efecto dispersor sobre biopelículas de L. monocytogenes. Se probaron 66 sobrenadantes obtenidos de cultivos de bacterias aisladas desde la Antártica, frente a 4 cepas de L. monocytogenes. Se realizaron ensayos de antagonismo en agar y anti-biopelículas en micro placa mediante la técnica de cristal violeta. También se realizaron ensayos en el sistema estándar de formación de biopelículas CDC biofilm reactor, para evaluar biopelículas formadas en soportes de acero inoxidable. Para evaluar las biopelículas se utilizó un kit de viabilidad bacteriana Baclight LIVE/DEAD, y un recuento total de bacterias adheridas a través de la técnica micro gota. De los 66 aislados de la Antártica, 28 mostraron un efecto sobre la biopelícula ya formada en micro placa. Se realizó una selección de 5 sobrenadantes a través de un análisis ANOVA (p <0 )
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE BACTERIAS AERÓBICAS HETEROTRÓFICAS, AISLADAS DESDE AMBIENTES ACUÁTICOS ANTÁRTICOS Y PATAGÓNICOS, BAJO CONDICIONES DE ESTRÉS; COMO INANICIÓN DE CARBONO Y CONGELAMIENTO.
Autor: Daniela Maldonado Molina.
Profesor Tutor: Dr. Miguel Martínez Poblete. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad de Concepción
RESUMEN
Los ambientes antárticos y patagónicos son conocidos como ambientes rigurosos por su baja temperatura y disponibilidad de nutrientes, es por esto que se ha señalado que los organismos que aquí habitan han desarrollado estrategias de supervivencia entre las cuales se encuentra la capacidad para captar ADN extracromosomal desde el ambiente. Esta propiedad les permite adquirir nuevas propiedades fisiológicas y genéticas. Por esta razón se postula que los factores ambientales como inanición de carbono y periodos de congelamiento permitirían incrementar la frecuencia de captación de ADN extracromosomal por transformación.
En este estudio se investigó en bacterias aeróbicas heterotróficas aisladas desde ambientes acuáticos de la Patagonia y Antártica chilena; Pseudomonas fluorescens (VC1), Pseudomonas sp. (LT14) y Pseudomonas sp. (RG8), disponibles en el Laboratorio de Microbiología Básica y Biorremediación estas cepas bacterianas fueron caracterizadas por su capacidad para adquirir ADN extracromosomal por transformación en inanición de carbono y congelamiento. Para esto, previamente se determinó la resistencia a antibacterianos para disponer de marcadores de selección, así como también se determinó la presencia de plásmidos en estas cepas.
Para la transformación se utilizaron los plásmidos alojados en la cepa Escherichia coli FT17 que codifica resistencia a antibióticos, kanamicina, ampicilina y tetraciclina, además del plásmido pBBR1, alojado en Escherichia coli, el cual codifica para la resistencia de kanamicina. Ambos plásmidos se caracterizaron por peso molecular, por electroforesis en geles de agarosa.
Se realizó transformación mediante la preparación de células competentes y transformación al término de la fase de crecimiento exponencial y se comparó las frecuencias y eficiencias de transformación, con las condiciones en estudio. Luego se transformó en condiciones de inanición de carbono y congelamiento. El proceso se realizó exponiendo las cepas bacterianas en estudio a condiciones de inanición de carbono, utilizando un medio mínimo salino, sin fuente de carbono, durante 5 días a una temperatura de 10°C. Luego se
expusieron las cepas bajo condiciones de congelamiento (-20°C), por 48 h. Además, antes y después de cada condición de estrés se realizó recuento bacteriano, para determinar la sobrevivencia de las cepas en dichas condiciones. La selección de las transformantes se realizó mediante la extracción de plásmidos en las cepas transformadas en geles de agarosa 0,8%, caracterizando los plásmidos extraídos, según su peso molecular.
Los perfiles de resistencia a antibióticos, mostraron que las 3 cepas en estudio fueron resistentes a ampicilina y cloramfenicol, propiedad no codificada en los plásmidos.
Los resultados mostraron que la cepa Pseudomonas fluorescens (VC1), adquirió los plásmidos pFT17 y pBBR1, siendo la frecuencias y eficiencias de trasformación mayores en la condición de congelamiento comparado con las células competentes. En las cepas Pseudomonas sp (RG8 y LT14), no se obtuvo transformantes en ninguna condición.
Los resultados en su conjunto sugieren que algunas bacterias aisladas desde ambientes considerados prístinos, como el patagónico y antártico poseen la capacidad para adquirir ADN extracromosomal por transformación. Esto podría permitir a bacterias de estos ambientes adaptarse a las oscilaciones del ambiente o bien estas cepas podrían adquirir genes de patogenicidad, pudiendo estos ambientes convertirse en reservorios de genes aloctonos, contribuyendo así a la contaminación genética de estos ambientes.
En este estudio se investigó en bacterias aeróbicas heterotróficas aisladas desde ambientes acuáticos de la Patagonia y Antártica chilena; Pseudomonas fluorescens (VC1), Pseudomonas sp. (LT14) y Pseudomonas sp. (RG8), disponibles en el Laboratorio de Microbiología Básica y Biorremediación estas cepas bacterianas fueron caracterizadas por su capacidad para adquirir ADN extracromosomal por transformación en inanición de carbono y congelamiento. Para esto, previamente se determinó la resistencia a antibacterianos para disponer de marcadores de selección, así como también se determinó la presencia de plásmidos en estas cepas.
Para la transformación se utilizaron los plásmidos alojados en la cepa Escherichia coli FT17 que codifica resistencia a antibióticos, kanamicina, ampicilina y tetraciclina, además del plásmido pBBR1, alojado en Escherichia coli, el cual codifica para la resistencia de kanamicina. Ambos plásmidos se caracterizaron por peso molecular, por electroforesis en geles de agarosa.
Se realizó transformación mediante la preparación de células competentes y transformación al término de la fase de crecimiento exponencial y se comparó las frecuencias y eficiencias de transformación, con las condiciones en estudio. Luego se transformó en condiciones de inanición de carbono y congelamiento. El proceso se realizó exponiendo las cepas bacterianas en estudio a condiciones de inanición de carbono, utilizando un medio mínimo salino, sin fuente de carbono, durante 5 días a una temperatura de 10°C. Luego se
expusieron las cepas bajo condiciones de congelamiento (-20°C), por 48 h. Además, antes y después de cada condición de estrés se realizó recuento bacteriano, para determinar la sobrevivencia de las cepas en dichas condiciones. La selección de las transformantes se realizó mediante la extracción de plásmidos en las cepas transformadas en geles de agarosa 0,8%, caracterizando los plásmidos extraídos, según su peso molecular.
Los perfiles de resistencia a antibióticos, mostraron que las 3 cepas en estudio fueron resistentes a ampicilina y cloramfenicol, propiedad no codificada en los plásmidos.
Los resultados mostraron que la cepa Pseudomonas fluorescens (VC1), adquirió los plásmidos pFT17 y pBBR1, siendo la frecuencias y eficiencias de trasformación mayores en la condición de congelamiento comparado con las células competentes. En las cepas Pseudomonas sp (RG8 y LT14), no se obtuvo transformantes en ninguna condición.
Los resultados en su conjunto sugieren que algunas bacterias aisladas desde ambientes considerados prístinos, como el patagónico y antártico poseen la capacidad para adquirir ADN extracromosomal por transformación. Esto podría permitir a bacterias de estos ambientes adaptarse a las oscilaciones del ambiente o bien estas cepas podrían adquirir genes de patogenicidad, pudiendo estos ambientes convertirse en reservorios de genes aloctonos, contribuyendo así a la contaminación genética de estos ambientes.
ESCALAMIENTO PRODUCTIVO DE BACTERIAS LÁCTICAS AISLADAS DE SALMONIDOS Y ESTUDIO DE SUS PROPIEDADES ANTIMICROBIANAS
Autor: Sebastián Martínez Ojeda.
Profesor Tutor: Msc. Margarita González Riquelme. Departamento de Bioquímica Clínica e Inmunología. Universidad de Concepción, Concepción
RESUMEN
El secado por atomización emplea 50% menos de energía que el secado por liofilización y su aplicación se enfoca en la producción de alimentos y también como un método de secado de cultivos de bacterias ácido lácticas (BAL). Sus principales ventajas radican en su rendimiento, fácil operación y bajo costo; sin embargo, tiene una gran limitante como es la preservación de la viabilidad bacteriana durante y después del secado. El objetivo de esta investigación es determinar que el secado por atomización en el proceso productivo, para lograr un probiótico deshidratado para la salmonicultura, no afecte el perfil de sus proteínas ni la actividad antimicrobiana de subproductos bacterianos obtenidos desde (BAL) deshidratadas mediante secado por atomización (D).
Cultivos bacterianos (109 UFC/mL) de Lactococcus lactis subsp. lactis cepa 148, Lactobacillus plantarum cepa 47 y Pediococcus acidilactici cepa 28 fueron centrifugados a 8000g durante 8 minutos a 4ºC, obteniendo un sobrenadante (SN1) que fue guardado a -20ºC. El pellet fue sometido a lisis mecánica con prensa French a 1000 psi, obteniendo un lisado bacteriano denominado homogenizado proteico soluble (HPS) cuyas proteínas fueron cuantificadas por el método de Bradford. También se dispuso de las cepas deshidratadas mediante secado por atomización y almacenadas durante 26, 18 y 6 días, las cuales fueron lisadas de la misma manera. La caracterización de las proteínas tanto de las BAL no deshidratadas (ND) como deshidratadas (D), se realizó mediante electroforesis (SDS-PAGE) en gradiente 8% y 15%. Para obtener anticuerpos policlonales de cada una de las cepas de BAL, se inmunizó conejos con 500μg de HPS de ND emulsificada con coadyuvante de Freund, obteniendo sueros inmune utilizados para la detección de proteínas inmunoreactivas que fue realizada mediante Inmunoblotting.
El análisis de SDS-PAGE para el HPS de las tres cepas revela diversas bandas proteicas cuyo PM varía entre 160 y 10 kDa. En las tres cepas de BAL, el análisis de resultados revela cambios en el perfil de proteínas que son posteriores al proceso de secado, ya que sólo se mantienen algunas bandas proteicas. El inmunobloting reafirma este resultado. Mediante el ensayo Microscale Optical Density Assay fue estudiado el potencial inhibitorio del sobrenadante (SN1) y del HPS de las BAL deshidratadas y no deshidratadas sobre el crecimiento de la bacteria Aeromonas salmonicida. Solamente el sobrenadante (SN1) de BAL 47 deshidratada demostró un potencial de inhibición significativo (p<0 data-blogger-escaped-47.="" data-blogger-escaped-a="" data-blogger-escaped-actividad="" data-blogger-escaped-aeromonas="" data-blogger-escaped-anti="" data-blogger-escaped-antimicrobiana.="" data-blogger-escaped-as.="" data-blogger-escaped-atomizaci="" data-blogger-escaped-bacteria="" data-blogger-escaped-bal.="" data-blogger-escaped-bal="" data-blogger-escaped-bandas="" data-blogger-escaped-conclusi="" data-blogger-escaped-conlleva="" data-blogger-escaped-crecimiento="" data-blogger-escaped-de="" data-blogger-escaped-del="" data-blogger-escaped-div="" data-blogger-escaped-el="" data-blogger-escaped-en="" data-blogger-escaped-la="" data-blogger-escaped-lactobacillus="" data-blogger-escaped-las="" data-blogger-escaped-liberados="" data-blogger-escaped-lisado="" data-blogger-escaped-los="" data-blogger-escaped-mero="" data-blogger-escaped-modifica="" data-blogger-escaped-modificaci="" data-blogger-escaped-n="" data-blogger-escaped-no="" data-blogger-escaped-obtenidas="" data-blogger-escaped-plantarum="" data-blogger-escaped-por="" data-blogger-escaped-posee="" data-blogger-escaped-proceso="" data-blogger-escaped-producida="" data-blogger-escaped-productos="" data-blogger-escaped-proteicas="" data-blogger-escaped-relaci="" data-blogger-escaped-salmonicida="" data-blogger-escaped-secado="" data-blogger-escaped-una="">
Cultivos bacterianos (109 UFC/mL) de Lactococcus lactis subsp. lactis cepa 148, Lactobacillus plantarum cepa 47 y Pediococcus acidilactici cepa 28 fueron centrifugados a 8000g durante 8 minutos a 4ºC, obteniendo un sobrenadante (SN1) que fue guardado a -20ºC. El pellet fue sometido a lisis mecánica con prensa French a 1000 psi, obteniendo un lisado bacteriano denominado homogenizado proteico soluble (HPS) cuyas proteínas fueron cuantificadas por el método de Bradford. También se dispuso de las cepas deshidratadas mediante secado por atomización y almacenadas durante 26, 18 y 6 días, las cuales fueron lisadas de la misma manera. La caracterización de las proteínas tanto de las BAL no deshidratadas (ND) como deshidratadas (D), se realizó mediante electroforesis (SDS-PAGE) en gradiente 8% y 15%. Para obtener anticuerpos policlonales de cada una de las cepas de BAL, se inmunizó conejos con 500μg de HPS de ND emulsificada con coadyuvante de Freund, obteniendo sueros inmune utilizados para la detección de proteínas inmunoreactivas que fue realizada mediante Inmunoblotting.
El análisis de SDS-PAGE para el HPS de las tres cepas revela diversas bandas proteicas cuyo PM varía entre 160 y 10 kDa. En las tres cepas de BAL, el análisis de resultados revela cambios en el perfil de proteínas que son posteriores al proceso de secado, ya que sólo se mantienen algunas bandas proteicas. El inmunobloting reafirma este resultado. Mediante el ensayo Microscale Optical Density Assay fue estudiado el potencial inhibitorio del sobrenadante (SN1) y del HPS de las BAL deshidratadas y no deshidratadas sobre el crecimiento de la bacteria Aeromonas salmonicida. Solamente el sobrenadante (SN1) de BAL 47 deshidratada demostró un potencial de inhibición significativo (p<0 data-blogger-escaped-47.="" data-blogger-escaped-a="" data-blogger-escaped-actividad="" data-blogger-escaped-aeromonas="" data-blogger-escaped-anti="" data-blogger-escaped-antimicrobiana.="" data-blogger-escaped-as.="" data-blogger-escaped-atomizaci="" data-blogger-escaped-bacteria="" data-blogger-escaped-bal.="" data-blogger-escaped-bal="" data-blogger-escaped-bandas="" data-blogger-escaped-conclusi="" data-blogger-escaped-conlleva="" data-blogger-escaped-crecimiento="" data-blogger-escaped-de="" data-blogger-escaped-del="" data-blogger-escaped-div="" data-blogger-escaped-el="" data-blogger-escaped-en="" data-blogger-escaped-la="" data-blogger-escaped-lactobacillus="" data-blogger-escaped-las="" data-blogger-escaped-liberados="" data-blogger-escaped-lisado="" data-blogger-escaped-los="" data-blogger-escaped-mero="" data-blogger-escaped-modifica="" data-blogger-escaped-modificaci="" data-blogger-escaped-n="" data-blogger-escaped-no="" data-blogger-escaped-obtenidas="" data-blogger-escaped-plantarum="" data-blogger-escaped-por="" data-blogger-escaped-posee="" data-blogger-escaped-proceso="" data-blogger-escaped-producida="" data-blogger-escaped-productos="" data-blogger-escaped-proteicas="" data-blogger-escaped-relaci="" data-blogger-escaped-salmonicida="" data-blogger-escaped-secado="" data-blogger-escaped-una="">
CARACTERIZACIÓN DEL GEN RIBOSOMAL 18S DE LA POBLACIÓN DE C. ROGERCRESSEYI EN SALMÓNIDOS DE CULTIVO Y ESTADIOS JUVENILES PLANCTÓNICOS EN CANAL KING (REGIÓN DE AYSÉN).
Autor: Pablo Oyarzún Andrade.
Profesor Tutor: Dr. Rodrigo González Saldía. Unidad de Biotecnología Marina. Universidad de Concepción, Concepción
Profesor Co Tutor: Dr. Fernando Cruzat Cruzat. Unidad de Biotecnología Marina. Universidad de Concepción, Concepción
RESUMEN
Caligus rogercresseyi representa uno de los principales problemas sanitarios y económicos que está enfrentando la salmonicultura chilena. Este es un copépodo parásito que se alimenta de la piel, sangre y mucosa de los peces (principalmente salmónidos cultivados) produciéndoles heridas, cambios osmóticos, estrés, etc.
Utilizando herramientas moleculares, se intentó determinar la relación genética que hay entre C. rogercresseyi adulto encontrado dentro de las jaulas de cultivo y las larvas planctónicas recolectadas en la columna de agua. Para esto, se secuenció un fragmento del gen 18s ARNr (686 pb), amplificado previamente mediante PCR convencional con partidores específicos para la especie. Las muestras analizadas de Caligus rogercresseyi adulto fueron obtenidas de 3 centro de cultivo ubicados en Canal King (Región de Aysén) y las larvas planctónicas fueron recolectadas en 12 transectos en el área adyacente a los centros.
Los resultados de las muestras adultas secuenciadas muestran 15 haplotipos, siendo el A el más frecuente (25%). Además se encontraron otros 14 haplotipos de menor frecuencia (B, J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U, V) distribuidos heterogéneamente entre los centros. Estos haplotipos poseen 19 polimorfismos nucleotídicos individuales (Single nucleotide polimorphysm: SNPs). El mayor número de SNPs se presenta en un reemplazo de la Adenina por otro nucleótido, mayoritariamente por Guanina, correspondiente a una mutación transicional.
Todas las muestras de larvas planctónicas analizadas mostraron una reacción PCR negativa utilizando los partidores específicos para esta especie. No obstante, esta reacción fue positiva cuando se utilizaron larvas de Caligus rogercresseyi eclosionadas en laboratorio. Esto indica, que las larvas planctónicas aquí analizadas, aunque morfológicamente pudieron ser clasificadas como C. rogercresseyi, no posee una relación genética directa con los adultos de esta especie presente en las balsas jaulas.
Los resultados aquí obtenidos, sugieren que si bien existe un haplotipo dominante (A), entre los centros de cultivo, cada centro posee su propio pool genético de Caligus rogercresseyi, lo que indicaría una auto-infestación de cada centro sin el aporte de larvas planctónicas, por cuanto las encontradas en el plancton en áreas adyacente a los centros de cultivo corresponden a una especie fenotípicamente similar, pero genéticamente distinta a los individuos que infestan a los peces de cultivo.
El siguiente paso podría ser establecer la relación entre el haplotipo mas frecuente y la resistencia adquirida a los tratamientos químicos que ha tenido Caligus rogercresseyi, con la meta de controlar este parásito.
Utilizando herramientas moleculares, se intentó determinar la relación genética que hay entre C. rogercresseyi adulto encontrado dentro de las jaulas de cultivo y las larvas planctónicas recolectadas en la columna de agua. Para esto, se secuenció un fragmento del gen 18s ARNr (686 pb), amplificado previamente mediante PCR convencional con partidores específicos para la especie. Las muestras analizadas de Caligus rogercresseyi adulto fueron obtenidas de 3 centro de cultivo ubicados en Canal King (Región de Aysén) y las larvas planctónicas fueron recolectadas en 12 transectos en el área adyacente a los centros.
Los resultados de las muestras adultas secuenciadas muestran 15 haplotipos, siendo el A el más frecuente (25%). Además se encontraron otros 14 haplotipos de menor frecuencia (B, J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U, V) distribuidos heterogéneamente entre los centros. Estos haplotipos poseen 19 polimorfismos nucleotídicos individuales (Single nucleotide polimorphysm: SNPs). El mayor número de SNPs se presenta en un reemplazo de la Adenina por otro nucleótido, mayoritariamente por Guanina, correspondiente a una mutación transicional.
Todas las muestras de larvas planctónicas analizadas mostraron una reacción PCR negativa utilizando los partidores específicos para esta especie. No obstante, esta reacción fue positiva cuando se utilizaron larvas de Caligus rogercresseyi eclosionadas en laboratorio. Esto indica, que las larvas planctónicas aquí analizadas, aunque morfológicamente pudieron ser clasificadas como C. rogercresseyi, no posee una relación genética directa con los adultos de esta especie presente en las balsas jaulas.
Los resultados aquí obtenidos, sugieren que si bien existe un haplotipo dominante (A), entre los centros de cultivo, cada centro posee su propio pool genético de Caligus rogercresseyi, lo que indicaría una auto-infestación de cada centro sin el aporte de larvas planctónicas, por cuanto las encontradas en el plancton en áreas adyacente a los centros de cultivo corresponden a una especie fenotípicamente similar, pero genéticamente distinta a los individuos que infestan a los peces de cultivo.
El siguiente paso podría ser establecer la relación entre el haplotipo mas frecuente y la resistencia adquirida a los tratamientos químicos que ha tenido Caligus rogercresseyi, con la meta de controlar este parásito.
DETECCIÓN DE BACTERIAS REDUCTORAS DE SULFATO FILAMENTOSAS TIPO BACTERIAS CABLE (FAMILIA DESULFOBULBACEAE) EN EL SULFURETO DE HUMBOLDT Y SUS APLICACIONES EN EL ÁREA DE LA BIOTECNOLOGÍA
Autor: Rocio Paleo Lopez.
Profesor Tutor: Dr. Víctor Ariel Gallardo Gallardo. Departamento de Oceanografía. Universidad de Concepción, Concepción
RESUMEN
Se ha descubierto que bacterias filamentosas de la familia Desulfobulbaceae conducen electrones en distancias de centímetros, acoplando las reacciones redox (oxígeno y sulfuro) de los sedimentos marinos. Estas no se han investigado en Chile, por lo que el objetivo del presente trabajo fue determinar la presencia de BRS filamentosas en el Sulfureto de Humboldt similares a las bacterias cable (Desulfobulbaceae), descubiertas en el estudio de Pfeffer et al., (2012), enfocando los experimentos en dos morfotipos bacterianos: bacterias similares a Desulfonema sp. (anacondas) y bacterias tipo cable eléctrico. Para ello, se colectaron y caracterizaron muestras de sedimentos durante septiembre (estaciones 4 y 7), y noviembre (estaciones 2, 4 y 7), del 2013 en la Bahía de Concepción. Desde cada muestra, las bacterias filamentosas fueron contabilizadas (bacterias/μL), fotografiadas y filmadas para analizar su morfología (longitud en mm), y patrón de movimiento. En forma paralela se analizaron muestras de sedimento y bacterias filamentosas en el Instituto de Biociencia de la Universidad de Aarhus (Dinamarca), donde se realizó un perfil de O2/H2S y FISH. En las muestras analizadas se encontró una gran diversidad de morfotipos de bacterias filamentosas. Del total de bacterias filamentosas contabilizadas para las estaciones 2, 4 y 7 se obtuvo que la estación 4 posee la mayor cantidad de bacterias filamentosas, donde el tipo similar a Desulfonema sp. (anaconda) y Candidatus Marithioploca son las más abundantes. No se contabilizaron bacterias tipo cable eléctrico en la estación 7. Del total de individuos medidos, la longitud promedio fue de 3,9 mm longitud para bacterias tipo cable eléctrico y 6,2 mm longitud para bacterias similares a Desulfonema sp. Se estimó que al primer milímetro de profundidad del sedimento, la concentración de oxígeno fue de 0 μM, y la concentración de H2S comenzó a aumentar en este mismo punto, hasta 250 μM a los 7 mm de profundidad. No se observó hibridación de las bacterias filamentosas con las sondas ELF645 (bacteria cable) y Dsb706 (BRS), por lo que no se logró asociar estos morfotipos con bacterias filamentosas de la familia Desulfobulbaceae. Sin embargo, no se descarta la posibilidad de encontrar bacterias filamentosas pertenecientes a otra taxonomía y con mecanismo de transporte de electrones similar al de las bacterias tipo cable eléctrico. Los resultados del presente trabajo corresponden al primer paso en la investigación de bacterias filamentosas reductoras de sulfato de la Bahía de Concepción, con un potencial uso en el área de la Biotecnología.
DETERMINACIÓN DEL POTENCIAL ANTIOXIDANTE DEL EXTRACTO DE
PINO RADIATA SOBRE CÉLULAS DE SALMÓNIDOS.
Autor: Jordán Roa Herrera.
Profesor Tutor: Dra. Allisson Astuya Villalón. Unidad de Biotecnología Marina. Universidad de Concepción, Concepción
Profesor Co-Tutor: Dra. Viviana Ulloa Jofre. Unidad de Biotecnología Marina. Universidad de Concepción, Concepción
RESUMEN
La salmonicultura es una de las actividades económicas más productivas en Chile. La exposición a factores ambientales bióticos y abióticos en las condiciones de cult ivo induce el estrés oxidativo, lo que potenciaría el desarrollo de enfermedades y el aumento de las pérdidas por concepto de mortalidad de los salmónidos. Por lo tanto, es fundamental la búsqueda de nuevos antioxidantes desde fuentes naturales para el desarrollo de alimentos funcionales. Diversos estudios indican que los extractos de corteza de pino poseen actividad antioxidante. En base a estos antecedentes, este trabajo de tesis tiene por objetivo determinar la actividad antioxidante del extracto de corteza de P. radiata en modelos in vitro de células de salmónidos mediante el ensayo cometa y la expresión relativa de genes de respuesta a estrés oxidativo por PCR en tiempo real (qPCR). La línea celular SHK-1 se expuso a una injuria oxidativa con peróxido de hidrógeno y mediante ensayo cometa se cuantificó la protección en el ADN del extracto de P. radiata. Los resultados se compararon con los antioxidantes vitamina C y astaxantina. Se determinó un efecto dosis-dependiente del extracto de P. radiata en la protección del ADN, donde 100 μg/mL mostró un efecto comparable con astaxantina y vitamina C. El efecto antioxidante de 50 μg/mL del extracto fue evaluado mediante el ensayo de expresión relativa del gen superóxido dismutasa (SOD) en células CHSE-214 expuestas a 3 μg/L de cipermetrina.
Aun cuando este inductor no produjo un aumento en la expresión de SOD, el extracto disminuyó la expresión basal de este gen. Nuestros resultados sugieren la transferencia de las propiedades antioxidantes del extracto de P. radiata a modelos celulares de salmonideos y sugieren su potencial uso en la elaboración de alimentos funcionales con actividad antioxidante para salmonicultura, resultados que deben ser comprobados mediante estudios in vivo.
Aun cuando este inductor no produjo un aumento en la expresión de SOD, el extracto disminuyó la expresión basal de este gen. Nuestros resultados sugieren la transferencia de las propiedades antioxidantes del extracto de P. radiata a modelos celulares de salmonideos y sugieren su potencial uso en la elaboración de alimentos funcionales con actividad antioxidante para salmonicultura, resultados que deben ser comprobados mediante estudios in vivo.
DETECCIÓN DE SAXITOXINAS MEDIANTE LA UTILIZACIÓN DE UN CONSTRUCTO REPORTERO
Autor: Karina Vega Drake.
Profesor Tutor: Dra. Allisson Astuya Villalón. Unidad de Biotecnología Marina. Universidad de Concepción, Concepción
Profesor Co-Tutor: Dra. Viviana Ulloa Jofre. Unidad de Biotecnología Marina. Universidad de Concepción, Concepción
RESUMEN
El Veneno Paralizante de Moluscos (VPM) es el grupo de ficotoxinas que presenta mayor preocupación en el mundo debido a los numerosos casos de intoxicaciones y mortalidad registrados. Actualmente, los métodos oficiales para su detección son el Bioensayo de ratón (MBA) y la Cromatografía Líquida de alta eficiencia (HPLC). El problema radica en que constantemente se están gestionando modificaciones en las legislaciones relativas a las metodologías y límites de detección, las que pretenden reemplazar el MBA por razones éticas y de sensibilidad, posicionando a las metodologías analíticas como oficiales. La desventaja de estos métodos es que sólo consideran la naturaleza físico-química y no el efecto biológico de las toxinas, por tanto no asegurarán a cabalidad la inocuidad de los alimentos que se pretenden comercializar. Ante este escenario, surge la necesidad de disponer de nuevas metodologías toxicológicas de screening y entre las cuales son excelentes candidatos los bioensayos celulares. El objetivo de esta tesis fue estandarizar un bioensayo celular alternativo para la detección de saxitoxinas basado en la inducción de un constructo reportero. Este constructo está formado por un vector que contiene el gen de luciferasa como gen reportero acoplado al promotor del gen c-fos sensible a la toxina, que fue transfectado en la línea celular N2A para evidenciar la presencia de saxitoxina (STX) mediante luminiscencia. En la etapa de estandarización se seleccionaron, desde bibliografía, tres potenciales inductores de la expresión endógena de c-fos para evaluarlos mediante la técnica de qPCR. Los resultados sugieren a propofol como un potencial inductor de c-fos bajo las condiciones ensayadas. Por otra parte, se observó una inhibición de la expresión del gen c-fos con saxitoxina 10nM, lo que corroboró la sensibilidad del gen frente al pre-tratamiento con esta toxina. Respecto a la estandarización de la transfecciones en células N2A, logramos establecer las condiciones experimentales óptimas para la transfección del constructo reportero sensible a la toxina, etapa inicial en el establecimiento del bioensayo celular para la detección de saxitoxina.
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