Evaluación de dietas probioticas sobre trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss [Walbum, 1792]): crecimiento y hematologia en cultivo a mediana escala.
Autor: Nelson Aravena Díaz.
RESUMEN
Los peces de cultivo están constantemente expuestos a diferentes patologías producidas por la presencia de altas concentraciones de microorganismos, esto ha llevado a un incremento en el uso de medicamentos y químicos en los sistemas acuáticos, con el fin de evitar altas mortalidades y generar un mejor producto. De manera alternativa al uso profiláctico de antibióticos para el control de enfermedades, viene siendo propuesto el término de probiótico, “microorganismos vivos, que al ser administrados en dosis adecuadas, confieren un beneficio de salud al receptor”. Por lo anterior se alado, se realizaron 2 ensayos, cada uno con 2 dietas probióticas diferentes. En el primer ensayo se evaluó la capacidad de estas dietas (LPS47 y Mix Probiótico) como posibles agentes promotores de crecimiento, la influencia de estas sobre los parámetros hematológicos y el sistema inmune no especifico y la capacidad de colonizar el tracto gastrointestinal de O. mykiss Para el ensayo 2, se evaluó la capacidad de otras 2 dietas probióticas (LPS28 y LPS148) como agentes promotores de crecimiento y el efecto de estas sobre algunos parámetros del sistema inmune no específico.
Para el primer ensayo los resultados obtenidos fueron comparados con un grupo control, en donde se observó un efecto promotor de crecimiento para las dietas LPS47 y Mix Probiótico, no se registraron efectos de estas sobre los parámetros hematológicos y las dietas fueron capaces de colonizar el tracto gastrointestinal y mucus de la piel. La dieta Mix Probiótico elevó los niveles de lisozima estimulando el sistema inmune no específico.
Para el ensayo 2, solo la cepa LPS148 actuó como promotor de crecimiento, descartando la utilización de la cepa LPS28 con este fin. Los valores de lisozima no fueron los esperados y la concentración de proteínas totales no se vio afectada por la incorporación de bacterias lácticas a las dietas.
Obtención y evaluación de la actividad biológica de extractos orgánicos de Durvillaea Antarctica (Chamisso) Hariot y sus proyecciones biotecnológicas.
Autor: Autor: Alejandro Arriagada Pérez.
RESUMEN
El objetivo de esta investigación consistió en extraer los metabolitos secundarios del alga marina Durvillaea antarctica responsables de su excepcional resistencia al ataque químico y biológico.
Para alcanzar su objetivo, la investigación adoptó como enfoque de laboratorio la extracción con solventes orgánicos de diferentes polaridades y temperaturas de ebullición.
Después de seleccionar el método de extracción se procedió a obtener los extractos de Durvillaea antárctica con los solventes; Éter Etílico, Metanol, Acetona, Cloroformo, Ciclohexano y Formamida.
A partir de los extractos secos, se procedió a estudiar su solubilidad en agua neutra, agua acidificada y agua alcalina, como etapa previa a la realización de los test de actividad antimicrobiana. Estos demostraron que los extractos obtenidos con Metanol, Acetona y Cloroformo mostraron una apreciable actividad antimicrobiana
Por razones ajenas a la investigación no se alcanzó a evaluar la actividad antioxidante de los extractos, aunque se logro identificar y preparar un test simple basado en la peroxidación del acido linoleico.
Análisis de la expresión génica de catalasa y superoxido dismutasa en Haliotis rufescens expuestos a estrés térmico.
Autor: Autor: Alejandro Castillo Lara.
RESUMEN
La formación de especies oxigeno reactivas (ROS) poseen un rol importante dentro del sistema inmune innato de invertebrados en presencia de organismos patógenos, constituyendo el principal mecanismo de defensa durante la fagocitosis. Dentro de este proceso, la acumulación de ROS produce estrés oxidativo celular, el que es regulado por la acción de enzimas antioxidantes como Catalasa (CAT) y Superoxido Dismutasa (SOD). Este estudio evaluó la expresión génica de CAT, SOD Cu/Zn y SOD Mn en abalon rojo, H. rufescens expuesto a estrés térmico. La extracción de ARN fue realizada a partir de diferentes tejidos (glándula digestiva, pie, gónada, manto, branquia, musculo y epipodio), seguido de la síntesis de cDNA. Los niveles de expresión de CAT y SOD fueron determinados mediante RT-PCR semicuantitativa utilizando como control interno β-actina. La caracterización génica resulto en secuencias parciales de 283pb para CAT, 414pb para SOD Cu/Zn y 483pb para SOD MM. El análisis de BLAST mostro altos porcentajes de cobertura e identidad con respecto a secuencias homologas de otras especies. Los alineamientos realizados con secuencias obtenidas desde GENBANK indicaron la presencia de zonas conservadas tanto en vertebrados como en invertebrados. El análisis filogenético mostro un agrupamiento mono filetico para las tres enzimas con valores de Bootstrap de 100% entre H. rufescens y H. discos discus para CAT, para SOD Cu/Zn se formo un clado integrado por H. rufescens, H discus discus y H. diversicolor con un soporte de Bootstrap de 81% donde se agrupo H. rufescens y H. discus discus y por ultimo para SOD Mn un valor de Bootstrap de 100% para el clado integrado por H. discus discus, H. cracherodii y H. rufescens donde se agrupo H. discus discos con H. cracherodii apoyado por un 79% dejando más alejado evolutivamente a H. rufescens. Los niveles de expresión genica variaron en cada tejido donde la mayor expresión la presento branquia y manto; y la menor en musculo para SOD Cu/En. Para SOD Mn la mayor expresión la presento el musculo y la menor el tejido digestivo; y para Catalasa la mayor expresión la presento branquia y la menor tejido digestivo. Los niveles de expresión génica variaron significativamente cuando los abalones fueron expuestos a estrés termico. Los niveles de expresión más altos fueron observados a 22°C para CAT, SOD Cu/Zn y SOD Mn. Los incrementos observados en la expresión evidencian la participación de estas enzimas en la regulación de los niveles de ROS por lo que este estudio apoya la potencial utilización de análisis de expresión de estas enzimas como indicadores de estrés oxidativo, daño celular, estado inmunológico e incluso de otras fuentes de estrés para H. rufescens.
Inducción a triploidía en abalón rojo, Haliotis rufescens mediante 6-DMAP.
Autor: Autor: Edgardo Castillo Sepúlveda.
RESUMEN
El abalón es un molusco gastrópodo que ha sido cultivado en Chile desde su introducción en la década de los 80 desde California, ha experimentado un rápido crecimiento, llegando hoy en día a una producción anual de 350 toneladas. Sin embargo, a nivel productivo no ha estado exenta de problemas destacando su crecimiento lento y los bajos calibres alcanzados en parte importantes de la producción, ya que tarda alrededor de 4 años en alcanzar su talla comercial e incluso muchos organismos no lo logran. Debido a esto la manipulación genética, y dentro de éstas la triploidía, cobra importancia como una mejora a las problemáticas de crecimiento, generando individuos con mayores tasas de crecimiento y estériles, lo que además podría permitir a futuro el cultivo en mar abierto sin problemas de reproducción en el medio natural. En la presente tesis se propone inducir a triploidía en abalón rojo, Haliotis rufescens, a través del inductor químico 6- DMAP, el que a su vez ya ha sido probado con éxito en otras especies de moluscos. La inducción a triploidía para retener el segundo corpúsculo polar se aplicó una vez que el 50% de las larvas liberó el primer corpúsculo polar, para lo cual se dispuso de tres concentraciones 50, 100 y 150<M de 6-DMAP, además de un control, por un tiempo de aplicación de 20 minutos, deteniendo la inducción por dilución con agua de mar microfiltrada. Posteriormente, se realizó un seguimiento de cultivo larval hasta las 72 horas post fecundación, estimando mortalidad, crecimiento e índice de triploidía en relación a las distintas concentraciones del inductor. La concentración óptima de 6-DMAP fue de 100<M. Finalmente, a través de la técnica de conteo cromosómico, se pudo comprobar que el químico 6-DMAP es capaz de inducir a triploidía en Haliotis rufescens.
Optimización de la acumulación de lípidos para la obtención de biodiesel en una cepa nativa aff. al género Tetraselmis.
Autor: Autor: Pablo Castro Varela.
RESUMEN
Chile es un país que importa la mayor parte de su energía por lo que existe un creciente interés, por diversificar la matriz energética, a partir de nuevas fuentes como lo son los recursos renovables. El biodiesel es un tipo de biocombustibles líquido, obtenido de grasas animales y aceites vegetales. Al respecto estudios realizados en algunas microalgas, principalmente el grupo de las algas verdes y diatomeas, han revelado su destacable capacidad de acumular grandes cantidades de ácidos grasos, lo que ha conllevado a considerarlas como una fuente de TAGs (Triglicéridos) para la conversión a biodiesel. Entre las algas verdes, destaca el género de Tetraselmis, ya que su contenido lipídico puede alcanzar entre un 15 y 20% del peso seco, dependiendo de la especie; sin embargo, esta producción puede ser incrementada a más del doble a partir de las modificaciones en las condiciones de cultivo, tales como deficiencia de nutrientes y alta intensidad lumínica. En el presente estudio se evaluaron los atributos fisiológicos de una cepa marina chilena aff. al género Tetraselmis cultivada bajo condiciones de déficit de nitrato y fosfato. Se determinó su crecimiento, como densidad celular y peso seco y además se cuantificaron sus lípidos totales. La combinación de nutrientes que más estimuló el crecimiento y acumulación de lípidos fue elegida para evaluar a la cepa en condiciones de alta irradianza. Además, se estandarizó y aplicó un programa de mejoramiento genético a través de mutagénesis al azar con etilenmetanosulfonato (EMS) y selección con los herbicidas Haloxifop y Quizalofop. Por otro lado, se secuenció la región ITS del cistrón ribosomal nuclear (ITS1-5.8S-ITS2) de la cepa en estudio con el fin de dilucidar su identidad taxonómica. Los resultados obtenidos señalan que la mayor acumulación de lípidos se obtuvo en condiciones de déficit de nitrato y fosfato (41.83% en peso seco), mientras que en condiciones de alta irradianza disminuyó el contenido de lípidos a valores similares a los obtenidos en condiciones de nitrato y fosfato normales (20% en peso seco). La aplicación del protocolo de mutagénesis estandarizado permitió generar 400 colonias resistentes a los herbicidas Quizalofop y Halozifop, los cuales deben aún ser evaluadas en cuanto a su crecimiento y acumulación de lípidos. La secuenciación de la región ITS permitió determinar que la especie más homóloga a la cepa estudiada corresponde a Tetraselmis suecica con un 99% de similitud.
Caracterización de las actividades proteolíticas de la glándula digestiva del molusco Concholepas concholepas (Brugière, 1789).
Autor: Autor: Viviana Cerda Llanos.
RESUMEN
Las proteasas son enzimas ampliamente distribuidas en vertebrados como en invertebrados, donde cumplen una función de gran importancia en la degradación y asimilación del alimento. Se han aislado una gran variedad de enzimas proteolíticas desde órganos internos de especies marinas como por ejemplo atún, carpa, sardina, pepino de mar, camarón, langosta y abalon azul, entre otros. El loco (Concholepas concholepas) es un recurso que por su atractivo precio a nivel global ha estado sometido a una fuerte presión extractiva, lo que provoco una disminución notable en los bancos naturales de este recurso y llevo a implementar medidas de protección tales como talla mínima, cuotas de extracción y vedas. Se ha estudiado la posibilidad de desarrollar el cultivo del loco, sin embargo, uno de los grandes problemas es su largo período de asentamiento larval, además de la alimentación a lo largo de todas las etapas de vida, ya que un individuo carnívoro, lo que ha generado desinterés en su cultivo. Por esto nos propusimos estudiar las proteasas ácidas y alcalinas presentes en la glándula digestiva del loco, para evaluar las características fisiológicas que este presenta. Para esto, la glándula digestiva de ejemplares vivos fue extraída y homogenizada para estudiar la presencia de actividades proteolíticas a diferentes pH mediante ensayos bioquímicos. La separación de las actividades enzimáticas se llevó a cabo mediante cromatografías de intercambio iónico a pH 7,5 y las actividades se ensayaron a pH 4,0; 7,0 y 12,0, siendo las mayores detectadas a pH 4,0. Se logró purificar una proteasa con un peso molecular de aproximadamente 30 kDa y un pH óptimo de 4,0. Mediante la utilización de agentes quelantes y modificadores de residuos de serina, identificamos esta enzima como una metaloproteasa. El modificador mencionado detectó la presencia de una proteasa tipo serina. Este estudio podría generar información hasta ahora no encontrada en registros científicos, lo que podría significar un aporte para la ciencia básica o aplicada.
Estudio de la decoloración de aceites de pescado: absorción de pigmentos por medio de bentonitas comerciales acido activadas.
Autor: Autor: Javier Córdova Gatica.
RESUMEN
El color pardo en algunos alimentos está íntimamente asociado a un producto delicioso y de alta calidad, pero para el caso de aceites y grasas comestibles esta percepción de calidad se ve alterada ya que estos alimentos con colores muy obscuros se asocian a un producto oxidado y de baja calidad nutricional. Es por este motivo que surge la necesidad de decolorar el aceite de pescado. La decoloración de los aceites se realiza por medio de un fenómeno físico o químico, llamado adsorción, el cual implica la eliminación de los pigmentos existentes, ya sea en forma de disolución en el aceite o en forma de partículas dispersas coloidalmente. Para realizar este estudio se contó con aceite de pescado neutralizado de la planta de refinación de aceite de pescado Socosep Ltda. y tres tipos de materiales adsorbentes, bentonitas comerciales (Tonsil optimum-FF, Pure-Flo® Supreme Pro-Active y Pure-Flo Supreme B-81). El proceso de blanqueo se llevó a cabo calentando al vacío 100 gramos de aceite neutralizado, en una placa calefactora con agitación magnética. Las concentraciones de los materiales adsorbentes utilizadas fueron de 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.5; 3.0, 4.5 y 6.0% p/p con respecto al aceite, a 85, 90 y 110ºC. Se tomaron muestras de aceite a los 15, 30, 45 y 60 minutos. Las muestras de aceite blanqueado fueron medidas por espectrofotometría a 440 nm y comparadas de acuerdo a la transmisión indicada con respecto a la escala de color Gardner. Los resultados obtenidos indicaron que la bentonita Pure-Flo Supreme B-81, de carácter levemente ácido, presentó la mejor interacción hacia estos pigmentos. Las isotermas de adsorción demostraron que la capacidad de adsorción de pigmentos está íntimamente relacionada a la temperatura y dosificación del adsorbente, encontrándose que a menores temperaturas la adsorción de pigmentos se favorece, lo mismo que para mayores concentraciones de adsorbentes. La ecuación de Freundlich, que mide la cantidad de pigmento adsorbido por unidad de masa, se ajustó mejor al modelo de adsorción, lo que indicaría una mayor heterogeneidad por parte de las superficies de las bentonitas utilizadas. Esto debido a la participación de enlaces fuertes y débiles en los sitios de adsorción. La entalpía de adsorción encontrada fue negativa por lo que la adsorción de pigmentos en el aceite de pescado es del tipo física. Si bien las tres bentonitas tienen una buena afinidad hacia los pigmentos, éstas no son capaces de una total remoción, determinándose resultados insatisfactorios, al no lograr el color comercial deseado.
Construcción de vector homólogo de expresión génica y transfección de espermatozoide de abalón rojo (Haliotis rufescens).
Autor: Autor: Diego Forttes Gómez.
RESUMEN
El abalón es un molusco de gran importancia comercial en la acuicultura de diversos países. A pesar del creciente interés en el cultivo de abalón, su lenta y variable tasa de crecimiento ha complicado a la industria y ha resultado ser foco de atención en estudios genéticos. La implementación de programas de mejoramiento genético ha propuesto como herramienta la utilización de organismos genéticamente modificados (OGMs), los cuales proporcionan un poderoso sistema de estudio in vivo y podrían llevar a la obtención de abalones transgénicos con mayores tasas de crecimiento, menores tiempos de producción y más resistentes a enfermedades. La utilización de vectores de expresión para la obtención de OGMs, así como la utilización de secuencias homólogas en la construcción de éstos, se ha incrementado fuertemente debido a su mayor eficiencia y aceptación con propósitos comerciales y normativos. El presente estudio describe la construcción de un vector de expresión homólogo y la utilización de espermatozoides de abalón rojo (Haliotis rufescens) como vectores de transferencia génica. Los resultados muestran que es posible construir un vector de expresión génica homólogo para H. rufescens, utilizando la región promotora de la proteína actina. Además, es posible que este vector sea integrado al interior de espermatozoides de abalón rojo mediante incubación con ADN plasmidial. La producción de abalones genéticamente modificados mediante espermatozoides como vectores de transferencia génica podría ser considerad como una alternativa viable en la especie H. rufescens.
Incidencia de la biomasa microalgal en la DQO, DBO5 y SST presente en efluente de lagunas de estabilización facultativas de Negrete y Curanilahue, VIII región.
Autor: Autor: Iván García Wells.
Profesor: Sra. Natalia Carvajal Cantero. (ESSBIO S. A.))
RESUMEN
El presente estudio tiene como objetivo analizar la incidencia de la concentración de biomasa microalgal sobre los índices de sólidos suspendidos totales (SST) y contaminantes de tipo orgánico como la demanda bioquímica de oxigeno (DBO5) y demanda química de oxigeno (DQO), presente en el efluente de dos lagunas de estabilización facultativas que procesan las aguas residuales de las comunas de Curanilahue y Negrete, VIII región. En las lagunas facultativas se produce una complementación biológica entre algas y bacterias presentes en el sistema. Las bacterias son las encargadas de la biodegradación de la materia orgánica que viene en el influente, lo que es transformado en agua, dióxido de carbono y aumento de biomasa. El dióxido de carbono y la luz son utilizados por las algas en su proceso metabólico, proceso que se caracteriza por la producción de oxigeno, elemento vital para la biomasa bacteriana. Esta biomasa microalgal por lo tanto, corresponde a una nueva forma de materia orgánica que ha sido generada en la laguna de estabilización, pero debido a su baja sedimentación es parte del efluente y, por tanto, se manifiesta como carga orgánica en éste, distorsionando los reales niveles de depuración que alcanzan las lagunas de estabilización como consecuencia de la actividad bacteriana. Es, por lo tanto, importante diferenciar la fracción correspondiente a esta biomasa microalgal en los parámetros de control que informan de la eficiencia del sistema. Para cuantificar la biomasa microalgal se realizó un cultivo tipo “batch”, con algas aisladas desde las mismas lagunas de estabilización. La microalga predominante en ambas lagunas fue Euglena sp. El cultivo se realizó en matraces de 5 L, a temp. ambiente 20 ± 2ºC y bajo iluminación continua a 2000 lux y agitación constante. Luego de obtener una cantidad suficiente de biomasa microalgal, se extrajeron muestras para realizar los análisis de DBO5, DQO y SST. Se cuantifico la clorofila “a” (mg/L) del cultivo de microalgas, a distintas diluciones, las cuales están asociadas a concentraciones de biomasa. Posteriormente se determinó empíricamente los datos de SST, DBO5 y DQO del cultivo microalgal, empleando las técnicas descritas en el libro de métodos para análisis de aguas “Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater”. A partir de éstos datos se obtuvieron correlaciones de estos parámetros en función de la concentración de biomasa algal. La fracción de DQO; DBO5 y SST que corresponde a la biomasa algal se determinó a través de la fórmula de aplicación del balance de materia [DQO total efluente- DQO correlación algal=DQO (materia orgánica no tratada)] y con los datos obtenidos empíricamente. Se utilizó igualmente esta aplicación del balance de materia para los otros parámetros en estudio. La biomasa microalgal [como clorofila “a” (mg/L)] producida en las lagunas de estabilización facultativas de las comuna de Curanilahue y Negrete, incide en un 73% en la DQO, un 44% en la DBO5 y un 81% en los SST, para la primera laguna, y en un 26 % en la DQO, un 17% en la DBO5 y un 38% en los SST, para la segunda laguna. Podemos concluir que la incidencia de la biomasa microalgal sobre los índices de calidad de ambos efluentes es considerable.
Detección del virus de la anemia infecciosa del salmón (ISAV) desde la columna de agua y estudio de su propagación en especies de fauna nativa.
Autor: Autor: Maritza Grandon Sanchez.
RESUMEN
El virus ISA ha sido detectado en salmónidos y en un par de especies nativas en el hemisferio norte. En Chile, el primer brote de virus ISA se produjo en el Salmón Atlántico (Salmo salar) en junio de 2007 en un centro de cultivo ubicado en la isla Lemuy, Chiloé X Región. La interacción de la partícula viral en organismos de vida libre, los factores ambientales que afectan su dispersión, su actividad en el medio marino en efluentes de plantas de proceso y sedimentos, entre otros, son ciertamente aún poco conocidos. El objetivo de este trabajo fue detectar la presencia de este agente patógeno en organismos de vida libre en dos áreas del ecosistema sur austral (Seno de Reloncaví y Canal Puyuhuapi). Para esto, se realizaron 484 análisis en muestras de tejidos de peces, moluscos, crustáceos, muestras de fecas de lobo marino y microplancton. Mediante RTPCR convencional y en tiempo real se verificó y cuantificó la presencia del virus amplificando los segmentos 6 y 8 de su genoma. Además, se clonó y secuenció el gen marcador de virulencia, hemaglutinina esterasa (segmento 6) del genoma viral. Los resultados indicaron ausencia del virus ISA para todas las muestras analizadas, excepto en una muestra de tejido muscular y cardíaco proveniente de Salmo salar de vida libre. Sin embargo, no se puede descartar la presencia en fauna nativa, sobretodo considerando los 50.000 ejemplares analizados en el hemisferio norte para este mismo patógeno. La cuantificación por RT-PCR en tiempo real para la muestra positiva del S. salar de vida libre indicó una carga viral mayor (músculo= 2,5 x 10 5 copias/μg y corazón= 4.8 x 108 copias/μg de ARN) que una muestra de esta misma especie proveniente de un centro en brote y utilizada como control positivo (5,9 x106 copias/μg de ARN). El análisis filogenético de la secuencia obtenida desde el salmón de vida libre infectado, comparado con la región HPR0 (cepa europea EU118820) y HPR7b (cepa chilena AM941715) mostró un 100% de homología con la segunda cepa descrita. HPR7b ha sido descrita como la cepa de mayor virulencia y más frecuente encontrada en los brotes de ISAV en Chile. Esta es la primera evidencia científica que demuestra la presencia del virus en organismos de vida libre del ecosistema sur austral abriendo una nueva perspectiva de estudio para entender la epidemiología de esta epizootia dentro de la complejidad de las interacciones entre especies dentro de un ecosistema.
Caracterización del ARNm de HSP70 en abalón rojo (Haliotis rufescenes) y análisis de su expresión en híbridos de abalón (Haliotis rufescenes x H. discushannai).
Autor: Autor: Gustavo Nuñez Acuña.
RESUMEN
Las chaperonas moleculares son componentes de la célula que permiten el correcto plegamineto de proteínas después de ser afectadas por condiciones de estrés. Dentro de ellas, la proteína de shock térmico 70 (Hsp70) es la chaperona más importante en la respuesta celular a condiciones de estrés térmico. Este trabajo reporta la secuencia del ARNm de Hsp70 en Haliotis rufescens (abalón rojo), los niveles de expresión de este gen en distintos tejidos para la especie y los niveles de expresión del gen de Hsp70 en híbridos de abalón (Haliotis rufescenes x H. discus hannai) después de exponer a los individuos a distintos tratamientos de shock térmico. Se extrajo ARN total de distintos tejidos de abalón rojo, del cual se amplificó el gen Hsp70 utilizando primers obtenidos desde trabajos anteriores y otros diseñados.
Bacterias lipolíticas adaptadas a bajas temperaturas: una nueva ventana para biotecnología.
Autor: Autor: Roberto Núñez López.
RESUMEN
Los ambientes permanentemente fríos han sido exitosamente colonizados por una clase de microorganismos extremófilos que se conocen como psicrófilos. La capacidad de crecer a temperaturas que están cercanas al punto de congelación del agua requiere de adaptaciones para mantener las tasas metabólicas y un crecimiento sostenido y compatible con la vida en estas condiciones ambientales consideradas severas. Se propuso el estudio de microorganismo que se encuentran en ambientes psicrófilos, para estudiar su actividad enzimática, específicamente su actividad lipolítica. Para esto se realizó una búsqueda en bacterias aisladas desde la Antártica y Patagonia chilena que se encuentran en el laboratorio de microbiología en la Universidad de Concepción para conocer su actividad lipolítica para lo cual se realizó un ensayo en un medio selectivo (agar tributirina), encontrándose dos cepas que mostraron mayor actividad lipolítica presuntiva pertenecientes al grupo de Stenotrophomonas maltophilia y denominadas ATH-6 y ATH-2. Posteriormente se determinó su cinética de crecimiento terminando la fase exponencial a las 24 y 48 h. para ATH-6 y ATH-2 respectivamente. Se evaluó la relación de actividad y producción de enzima a distintas temperaturas y pHs donde ATH-6 obtuvo una mayor actividad a 25ºC y a pH 7.4, en cambio la cepa ATH-2 obtuvo mayor actividad a 10ºC y a pH 5.0, al mismo tiempo se evaluó la expresión de la actividad en distintos parámetros físico-químicos (temperatura y pH ). La mejor actividad se evidenció a los 25ºC para ambas enzimas y a un pH de 8.0. También se determinó la estabilidad enzimática a diferentes temperaturas donde la enzima de la cepa ATH-6 presento mayor estabilidad térmica que ATH-2 (-20ºC hasta los 60ºC). La estimación del rango de peso molecular se realizó en unidades amicon dando como resultado un rango mayor o igual a 50kDa. Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) arrojó un resultado inesperado ya que se obtuvieron 2 bandas de diferentes pesos moleculares lo que sugiere que estas enzimas forman dímeros (isoenzimas) de aproximadamente 28 y 18 kDa. Las condiciones climáticas Antárticas producen una importante cantidad de lípidos proveniente por una parte de la acción del hombre (hidrocarburos utilizados en estos lugares) y los desechos de organismos que habitan en ese lugar (pingüinos, focas) y de la muerte de estos, que son aprovechados por estas bacterias autóctonas productoras de lipasas lo cual potencia su utilización en la biotecnología.
Diversidad microbiana a través del marcador genético 16s rRNA en el Canal Puyuhuapi, Chile: exploración de genomas de interés para la biotecnología marina.
Autor: Autor: Paulina Palacios Suazo.
RESUMEN
El área de los fiordos en la Patagonia chilena se caracteriza por una gran productividad primaria al inicio de la primavera, siendo consideradas aguas prístinas y escasamente estudiadas. Así también, todo lo relacionado a la biogeoquímica del canal Puyuhuapi aun no es bien entendida y el rol del metabolismo microbiano y los genomas que lo contienen son ciertamente desconocidos. La diversidad microbiana constituye la más extraordinaria reserva genética y es clave para la supervivencia humana, por ser un enorme reservorio de recursos potencialmente utilizables en procesos biotecnológicos. El objetivo principal de esta investigación fue determinar la diversidad microbiana a través del marcador genético 16s rRNA, y comparar el efecto de la estacionalidad primavera-verano en la columna de agua del Canal Puyuhuapi, para el dominio de Bacteria y Archaea. Se utilizaron muestras recolectadas de la columna de agua del Canal Puyuhuapi y se extrajo ADN desde el material filtrado de la columna de agua (mayor a 0.22 μm). Este material fue amplificado mediante PCR utilizando partidores específicos para el gen 16s rRNA de bacteria y archaea. Para determinar la diversidad en estos grupos microbianos se realizó un análisis electroforético utilizando geles DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) a partir de los fragmentos 16s rDNA amplificados. Los amplicones fueron clonados y secuenciados (Macrogen, Corea). El análisis genético de las comunidades procarióticas estudiadas, revelo una mayor diversidad para el dominio de bacteria con respecto a las archaea. La mayor diversidad de OTUs (Operacional Taxonomic Unit) y número de ocurrencia de bandas se observó en la parte sur del canal Puyuhuapi, a los 25 y 50 metros de profundidad. De las 6 bandas del dominio de archaea secuenciadas 5 de ellas presentaron un alto porcentaje de identidad con secuencias descritas en las bases de datos para archaea de interés para la producción de energía. Por lo tanto se puede concluir que la comunidad microbiana involucrada en la actividad biogeoquímica del canal Puyuhuapi es genotípicamente dinámica por cuanto cambia entre primavera y final del verano durante el periodo estudiado y que además puede ser un reservorio de microorganismo de interés para biotecnología marina.
Producción de anticuerpos policlonales contra virus ISA: un patógeno de salmónidos cultivados en el ecosistema sur austral de Chile.
Autor: Autor: Gabriela Palma Oporto.
RESUMEN
La anemia infecciosa del salmón es una enfermedad que afecta principalmente al Salmón del Atlántico (Salmo salar) y es provocada por el virus ISA. Este patógeno pertenece a la familia Ortomyxoviridae y ha provocado grandes pérdidas en la industria salmonera. Dentro de las técnicas utilizadas para su diagnóstico se realizan ensayos inmunológicos con el uso anticuerpos monoclonales desarrollados en cepas del virus perteneciente al hemisferio norte. El uso de estos anticuerpos ha presentado problemas en la detección de cepas chilenas del virus debido a la baja sensibilidad y carencia de especificidad, siendo necesario el desarrollo de herramientas que permitan obtener resultados confiables que disminuyan la ocurrencia de falsos negativos. En este trabajo se desarrollaron anticuerpos policlonales contra virus ISA, en conejos de laboratorio. Para ello partículas virales fueron aisladas por medio de ultracentrifugación en gradiente discontinuo desde sobrenadantes de cultivos celulares infectados con el virus. Las partículas aisladas fueron adsorbidas a la superficie de eritrocitos de conejos y utilizadas como inmunógeno. Micrografías del inmunógeno demostraron la presencia de partículas virales de 70 a 137nm de diámetro hemadsorbidas o endocitadas en eritrocitos de conejos. La obtención de los sueros inmunes, desde los conejos inmunizados, fueron caracterizados mediante técnicas de hemaglutinación y enzimainmunoensayos (ELISA). Los resultados obtenidos en la hemaglutinación demostraron mayores respuestas con los sueros del 2º y 3º sangrado. Los resultados de ELISA, no fueron concluyentes sugiriendo la necesidad de contar con partículas virales purificadas para la realización de este ensayo.
Determinación de la actividad de proteínas anticongelantes en cepas bacterianas aisladas de la Antártica Chilena.
Autor: Autor: Alejandro Poblete Olivares.
RESUMEN
En acuicultura la criopreservación de espermatozoides es una técnica utilizada que permite almacenar los excedentes obtenidos para utilizarlos posteriormente. Este proceso, requiere disminuir la temperatura gradualmente y de manera controlada para minimizar los daños ocasionados por la formación de cristales de hielo. Las proteínas anticongelantes pertenecen a un grupo de proteínas de muy diversas estructuras y que han sido descritas en peces, hongos, plantas, insectos y bacterias, y que son capaces de otorgar protección a las células por debajo de temperaturas de congelamiento uniéndose a los cristales de hielo. En esta investigación se trabajó con diferentes cepas bacterianas aisladas desde la Antártica Chilena y una cepa, Pseudomona sp. FN<41 aislada del norte de Chile. Debido a las bajas temperaturas a las que se encuentran expuestas, estas cepas podrían presentar proteínas anticongelantes como un mecanismo de resistencia al frío (aunque también, existen otros mecanismos para resistir las temperaturas de congelamiento, como modificaciones en la membrana plasmática). Para detectar la actividad de proteínas anticongelantes en las cepas bacterianas, se realizó una extracción de proteínas totales incubando los cultivos a 25 ºC por 24 horas y a 5 ºC por 7 días y una extracción de proteínas periplasmaticas por shock osmótico incubando a 10 ºC por 7 días y a 5ºC durante 7 días. A los extractos de proteínas obtenidos se les determinó actividad anticongelante por calorimetría diferencial de barrido (DSC), congelando las muestras a una tasa de enfriamiento de 0.5ºC/min. haciendo un barrido de temperatura desde 6 ºC hasta los <6ºC. De los análisis por DSC los extractos crudos de proteínas totales de las cepas Stenotrophomonas maltophilia ATH<6 y Pseudomona sp. FN<41 mostraron un descenso en el punto de congelamiento en comparación al control negativo E. coli K<12, de los extractos de proteínas periplasmáticas solo se obtuvieron resultados de las muestras provenientes de las cepas ATH<8 y E. coli K<12, estas se congelaron a temperaturas similares <3.65 ºC y <3. 84 ºC respectivamente. Los resultados obtenidos de los extractos de proteínas totales de la cepa Antártica Stenotrophomonas maltophilia ATH<6 y Pseudomona sp. FN<41 sugieren la presencia de proteínas anticongelantes que pueden unirse a los cristales de hielo y disminuir la temperatura de congelamiento. Sin embargo, es necesario realizar análisis que ratifiquen la presencia de estas proteínas.
Caracterización y análisis de expresión de ferritina en abalón rojo (Haliotis rufescens).
Autor: Autor: Karina Salinas Clarot.
RESUMEN
Ferritina es una proteína que constituye la principal forma de almacenamiento de hierro en la célula. Su capacidad para captar el exceso de hierro altamente tóxico de una forma compacta y segura dota a esta proteína con una función detoxificante y de reserva de hierro, cumpliendo un rol fundamental en la homeostasis celular y en la defensa celular contra el estrés oxidativo producido por las especies reactivas de oxígeno (ROS). Su estudio puede ser un aporte relevante para especies de importancia comercial en acuicultura como el abalón rojo Haliotis rufescens, que desde etapas tempranas en cultivos está expuesto a factores de estrés como la temperatura que inducen la formación de ROS que tienen la capacidad de dañar las biomoléculas del organismo y producir el desarrollo de diversas enfermedades. En este estudio se determina la secuencia codificante de 516 pb de la subunidad Abf2 del ARNm de ferritina en abalón rojo y se analiza su nivel de expresión a través de RT-PCR semicuantitativo exponiendo a los organismos a distintas condiciones de estrés térmico, como también su nivel de expresión en tejidos como manto, músculo, pie, branquias, gónadas y glándulas digestivas. Los resultados obtenidos demuestran que la expresión de ferritina es inducida por los aumentos de temperatura, debido a la represión de ferritina ante los aumentos de ROS generados por el estrés térmico y que este gen es expresado en varios tejidos del abalón como con una amplia distribución.
Evaluación de la actividad antagónica de bacterias antárticas sobre patógenos de acuicultura.
Autor: Autor: Ruth Sánchez León.
RESUMEN
El creciente desarrollo de la acuicultura en Chile, ha traído consigo gran cantidad de problemas relacionados con ictiopatologías, junto con pérdidas económicas por la alta mortalidad de individuos. Como medida de mitigación, la práctica de la industria acuícola es usar antibióticos en forma excesiva y sin regulación, ya sea como medida profiláctica o tratamiento a enfermedades infecciosas, trayendo como consecuencia, la emergencia de bacterias resistentes a antibióticos que dificultan el adecuado tratamiento de enfermedades. Comúnmente, las soluciones para hacer frente a la prevalente resistencia a los antibióticos involucran el uso racional de éstos y el descubrimiento de nuevos agentes antimicrobianos.
El continente Antártico se caracteriza por tener condiciones climáticas extremas debido a las bajas temperaturas que se presentan a lo largo de todo el año, lo que provoca un aislamiento y escasa intervención antrópica, transformándose en un ecosistema prácticamente en condiciones prístinas. El desarrollo de las especies es muy diferente al que nosotros conocemos, existiendo principalmente formas de vida microbiana. Por las características particulares de la biota antártica, es que los organismos que allí subsisten poseen una estructura genética y bioquímica única. Las bacterias existentes en la Antártica deben hacer frente a todas estas condiciones adversas utilizando mecanismos de protección y competencia frente a otros microorganismos. Uno de estos mecanismos son las interacciones antagónicas que implican la inhibición del crecimiento de uno de los organismos por parte del otro y les confiere ventajas selectivas. Numerosos estudios se centran en la búsqueda de sustancias antagónicas de bacterias mesófilas sobre patógenos marinos o terrestres, aunque existen escasos estudios de bacterias psicrotolerantes como productoras de sustancias antimicrobianas.
El objetivo del presente trabajo es determinar la actividad antagónica de bacterias aisladas en la Península Fildes, Isla Rey Jorge del Territorio Chileno Antártico sobre patógenos de los géneros Vibrio, Aeromonas, Flavobacterium y Halomonas, los cuales afectan a cultivos acuícolas de importancia comercial.
Se trabajó con 100 cepas antárticas aisladas de diferentes sustratos como agua, lodo, hielo, musgo y sedimentos. Los patógenos utilizados fueron Vibrio splendidus, Vibrio parahaemolyticus, Halomonas sp., Aeromonas hydrophila y Flavobacterium sp., que afectan a individuos de cultivos acuícolas. Para medir la actividad antagónica se utilizó el método de inhibición con discos de agar y para evaluar la estabilidad de la actividad antagónica se realizó tratamientos al sobrenadante de cultivo.
Identificación y evaluación de compuestos con actividad biológica aislados desde el equinodermo Athyonidium chilensis. (Echinodermata, holoturoidea).
Autor: Autor: Ignacio Sottorff Neculhueque.
RESUMEN
En la actualidad existe una demanda considerable de nuevas moléculas bioactivas de potencial uso biomédico y que además sean amigables con la naturaleza. Bajo esta perspectiva, se estudió el invertebrado marino Athyonidium chilensis, un equinodermo perteneciente a la familia Holothuridae, que habita la zona intermareal de la costa chilena. El material de trabajo de este estudio fue recolectado en la comuna de Tomé, región del Bío Bío, Chile. El desarrollo del trabajo se realizó utilizando extracciones con solventes de polaridad creciente (diclorometano y metanol), técnicas cromatográficas y espectrometría de masas. La purificación cromatográfica, basada en la presencia de saponinas fue detectada mediante el test de hemólisis de glóbulos rojos en agar sangre. De este modo se llego a un extracto purificado que contenía tres glucósidos, con masas de 508,5, 1015 y 1544 Da. Además, se probó la capacidad antibacteriana de estos compuestos frente a S. aureus, B. subtilis y la actividad antifúngica contra C. albicans, Botrytis sp., Rhysopus sp. y Aspergillus sp. Además, se evaluó el CL-50 24 hrs, en la línea celular CHSE-214 proveniente de salmón Chinook, observándose que a concentraciones menores a 0,3 mg/mL los compuestos resultan inocuos.
Identificación de cepas bacterianas ácido lácticas de peces salmonídeos, con actividad prebiótica a través del análisis del gen ribosomal 16S.
Autor: Autor: Nicolás Troncoso León.
RESUMEN
El uso de probióticos se ha convertido en un medio alternativo al empleo de antibióticos para reducir enfermedades y aumentar la productividad en la acuicultura. El objetivo principal de la presente investigación, fue identificar las cepas bacterianas previamente caracterizadas como Lactobacillus plantarum, con actividad probiótica, LPS (Lactobacilo Probiótico de Salmón), a través de métodos fenotípicos. Con la finalidad de identificar distintos MOTUs (Unidad Taxonómica Operativa Molecular) en las cepas, se usó técnicas moleculares, como la Reacción en Cadena de la Polimerasa – Electroforesis en Gel con Gradiente Denaturante (PCR–DGGE), para esto se utilizan los partidores universales para bacterias 8 –F y 907–R, y los productos fueron analizados en geles de poliacrilamida al 6% (acri/bisacrilamida 37,5:1) con un gradiente de 45 – 53 % (post estandarización). Además se procedió con el proceso de clonación y posterior secuenciación parcial del gen ARNr 16S de un segmento cercano a 900 pb (pares de bases). Los resultados dan cuenta de la presencia de dos MOTUs por cada cepa LPS ensayada, con un total de cuatro unidades entre las cepas en estudio. La secuenciación parcial de LPS 28, y posterior comparación a través de análisis BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) identificó, con un 99.8% de similitud, a esta cepa como Pediococcus acidilactici. conclusión, los cultivos LPS testeados no se encuentran puros como indican análisis de DGGE, a su vez, la identificación fenotípica por medio del kit API 50 CHL no coincide con la identificación determinada por método molecular, para LPS – 28, que identifico a esta cepa como Lactobacillus curvatus. Los otros casos de estudio LPS – 47 y 148 no resultaron exitosos.
Actividad anti-microfouling de extractos de plantas de flora nativa chilena.
Autor: Autor: José Miguel Vidal Araya.
RESUMEN
La colonización temprana de microorganismo seguida por el asentamiento de macroorganismos en superficies artificiales o naturales, expuestas en el medio marino es denominada biofouling. Y es responsable de millonarias pérdidas económicas para distintas industrias del rubro marítimo. Desde la prohibición de pinturas antifouling en base a TBT por su efecto nocivo hacia el medio ambiente, la búsqueda de compuestos alternativos de origen natural ha incrementado notablemente, siendo propuestos macroorganismos marinos y bacterias simbiontes adheridas a ellos como productores de distintos compuestos antifouling. Comparativamente, escasa atención han tenido las plantas terrestres, siendo estas productoras de una gran cantidad de compuestos bioactivos y antimicrobianos. En Chile se han encontrado propiedades bioactivas documentadas para 561 especies de plantas autóctonas chilenas. En este trabajo, se estudió el efecto de 10 extractos de flora nativa chilena con actividad anti-Biopelículas y anti-Quorum Sensing, contra la formación de biopelículas de una comunidad de bacterias marinas pertenecientes al microfouling. Se obtuvo la comunidad de bacterias marinas desprendiendo células de una red de salmonicultura sumergida durante 15 días. El medio de cultivo CWS, fue seleccionado mediante PCR-DGGE. La comunidad mostró producción de AHL con la cepa reportera Agrobacterium tumefaciens A136, pero no con la cepa reportera Chromobacterium violaceum CV026. EL control positivo Vainillina solo mostró disminuir la formación de biopelículas al tener un efecto biocida en la fase planctónica. Los extractos Ex.A EX.B y Ex.C resultaron tener un efecto positivo en la disminución de células en la biopelícula, y esto fue observado mediante recuento de células (p<0.005) según el índice SBF, por microscopia electrónica de barrido (MEB) y mediante Electroforesis en gel con gradiente denaturante (DGGE). Los resultados de DGGE mostraron la desaparición de ciertas bandas, lo cual indicaría un posible efecto selectivo al inhibir la adhesión de ciertas cepas en biopelículas de microfouling. Los resultados entregados en este estudio confirman el potencial de las plantas terrestres como fuente de compuestos anti-microfouling. Sin embargo, estudios posteriores en los cuales se trabaje con macroorganismos pertenecientes al biofoulig, podrían atribuirle propiedades anti-Biofouling a los extractos positivos ensayados en este trabajo.
Análisis de los patrones de expresión de genes relacionados a la maduración sexual en abalón rojo (Haliotis rufescens).
Autor: Autor: Alejandro Gutiérrez Silva.
RESUMEN
Los mecanismos genético-moleculares involucrados en la reproducción y desarrollo gonadal en invertebrados marinos han sido escasamente entendidos. La maduración gonadal involucra complejos procesos y mecanismos que están controlados por la acción de una variedad de procesos bioquímicos y la acción de proteínas como factores de trascripción, enzimas, receptores esteroidales, entre otros. A partir de estudios anteriores ha sido posible identificar numerosos genes ortólogos los cuales son posibles de ser caracterizados a nivel de expresión génica. De esta manera, mensajeros con expresión diferencial entre machos y hembras han sido relacionados al desarrollo gonadal y han permitido una mejor comprensión del proceso gametogénico. Sin embargo, aun es necesario comprender en mayor detalle los procesos moleculares que se llevan a cabo durante la etapa de diferenciación sexual. El presente proyecto plantea el análisis de la expresión de diferentes genes relacionados a la maduración sexual en abalón rojo (Haliotis rufescens) específicamente proteínas como la tektina, involucrada en la formación de microtubulos en flagelos y cilios; proteínas de interacción gamética como la lisina, su receptor VERL y la proteína de fertilización; proteínas de la capa vitelina como VCP2 identificada en ambos sexos; la vitelogenina, fundamental en la formación del vitelo en óvulos; proteínas de interacción con receptores esteroidales como el SARIP. La identificación molecular de estos genes fue evaluada mediante RT-PCR semi-cuantitativo a partir de primers específicos para mensajeros de interés cuya expresión fue analizada durante el desarrollo gonadal del abalón rojo en etapas tempranas de desarrollo. Adicionalmente, se realizo un análisis histológico con la finalidad de evaluar la aparición de estructuras celulares relacionadas a la gametogenesis durante el desarrollo del animal. De esta manera se pudo establecer patrones de expresión diferencial que presentaron genes como VCP2, VERL, Vitelogenina y Lisina durante etapas que fueron identificadas como de mayor importancia en el desarrollo gonadal. De acuerdo a esto, el estudio y manipulación de los genes relacionados con el sexo en moluscos se plantea como una poderosa herramienta biotecnológica, ya sea como marcador de maduración gonadal o posible utilización en tecnologías de control de sexo.
